PDF《microorganism》

Progress and prospective of acetone-butanol fermentation by microorganism Xiaodan Wu1 , Yuhuan Liu2, 3* , Erni Xu1 , Roger Ruan3 1.

College of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China 2. The State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China 3. The Engineering Research Center for Biomass Conversion, MOE, Nanchang University, Nanchang 330047, China Email: [email protected] Abstract: As a kind of biomass-based fuel, butanol is better than ethanol. In addition, the acetone-butanol fermentation can also take full use of various simple sugars, such as glucose, fructose, xylose, and so on. With the characterization of colony morphology of Clostridium, analysis of metabolic mechanism, retrospection of recent research progress of strain breeding and fermentation technology, we prospected the acetone-butanol fermentation by microorganism. Moreover, special attention was paid to the progress of acetone-butanol fermentation by using hydrolyzed product of lignocellulosic biomass. Keywords: acetone-butanol;

fermentation;

strain breeding;

process optimization;

lignocellulose 微生物发酵法生产丙酮丁醇研究进展 巫小丹1 ,刘玉环2, 3* ,徐尔尼1 ,阮榕生3 南昌大学生命科学与食品工程学院,南昌,中国,330031 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,南昌,中国,330047 生物质转化教育部工程研究中心,南昌大学,南昌,中国,330047 Email: [email protected] 【摘要】丁醇是优于乙醇的生物质基燃料,而且丙酮丁醇发酵可以同时充分利用五碳糖和六碳糖.从 丙酮丁醇菌的菌落形态、生理生化特性和代谢机理出发,回顾近年来国内外生产菌种选育和发酵工艺 方面所取得的成就,展望微生物发酵法生产丙酮丁醇的开发前景,特别关注围绕以木质纤维素类生物 质及其水解产物作为底物的丙酮丁醇发酵工艺的进展. 【关键词】丙酮丁醇;

发酵;

菌种选育;

工艺优化;

木质纤维素 引言 木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源,其主 要成分为纤维素、半纤维素和木质素,其中纤维素和 半纤维素的水解产物为五碳糖和六碳糖,关于利用木 质纤维素发酵生产燃料乙醇的研究受到广泛重视,但 五碳糖的利用效率低下问题制约了发酵的效率.研究 发现,丙酮丁醇梭菌利用纤维二糖和木糖的效率与利 用葡萄糖的效率相当[1] ,而且丙酮、丁醇是两种非常 重要的化工原料和工业溶剂,丁醇在替代汽油作为燃 料方面性能优于乙醇.目前,微生物发酵法生产丙酮 丁醇尚不具有市场竞争优势,丁醇价格要比乙醇高一 倍以上,主要原因除了从木质纤维素中获取还原糖的 效率低下、发酵抑制物多外,丙酮丁醇发酵液中产物 浓度过低也是一个重要因素.但是以可再生的生物质 资源,特别是廉价丰富木质纤维素类生物质替代石油 基原料生产丙酮、丁醇,符合国家能源安全和粮食安 全的长远战略考虑,发展前景非常广阔.本文在分析 丙酮丁醇发酵代谢途径的基础上,结合近年来国内外 优良菌株选育和发酵工艺改良成果,提出以木质纤维 素为原料,利用微生物发酵的方法实现丙酮丁醇低成 本开发、高竞争力推广的策略.

1 菌种 1.1 种类

1914 年, Weizmann 从谷物中分离得到 Clostridium acetobutylicum Weizmann,该菌种能够发酵各种谷物 原料,为丙酮丁醇发酵的工业化奠定了基础.目前能 Supported by The Foundation of Key Technology Research Program of Biodiesel Industry in Jiangxi Province of China (2007BN12100);

NSFC Projects: 30960304;

Jiangxi Province NSF Projects: 2008GZH0047;

Special Project for Returned Scholar in Jiangxi Enterprise Pioneer Garden

2008718 * Corresponding author. Email: [email protected] 进行丙酮丁醇发酵的微生物主要是梭状芽孢杆菌属 (Clostridium) ,统称丙酮丁醇梭状芽孢杆菌,简称丙 丁菌,如C. acetobutylicum 、 C. beijerinckii 、 C. saccharoperbutylacetonicum 和C. saccharobutylicum 等[2] . 1.2 细胞、菌落特征 丙丁菌是一类严格厌氧的微生物, 属革兰氏阳性, 细胞呈梭状,细胞大小(0.6~0.9)μm*(2.4~4.7)μm. 芽孢卵圆形,次端生.表面菌落圆形、突起,直径 3~5mm,边缘不规则,色灰白,半透明,表面有光泽. 1.3 代谢途径分析 丙酮丁醇发酵分为产酸期和产溶剂期两个阶段. 发酵初期产生大量的有机酸如乙酸、 丁酸等, pH 值迅 速下降;

当达到一定酸度后,进入产溶剂期,有机酸 被还原,产生大量溶剂,主要产物丁醇、丙酮和乙醇 的比例为 6∶3∶1.丙丁菌的代谢支路较多,分析其 代谢途径, 对调整代谢方向、 控制发酵产物的比例 (如 提高丁醇的比例)具有重要的意义. 产酸期:葡萄糖经过糖酵解(EMP)途径产生丙酮 酸;

五碳糖通过磷酸戊糖途径(HMP),转化为 6-磷酸 果糖和 3-磷酸甘油醛,进入 EMP 途径产生丙酮酸. 丙酮酸和 CoA 在丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶的作 用下生成乙酰~CoA.乙酰~CoA 在磷酸酰基转移酶 (PTA)的作用下生成酰基磷酸酯, 接着在乙酸激酶(AK) 的催化下生成乙酸.乙酰~CoA 在一系列酶的催化下 生成丁酰~CoA,然后经磷酸丁酰转移酶(PTB)催化生 成丁酰磷酸盐,最后丁酰磷酸盐经丁酸激酶(BUK)去 磷酸化,生成丁酸.在该阶段中,有大量 CO2 和H2 产生, 同时 NADH 的大量积累为丁醇和乙醇的生成提 供了大量的还原力. 产溶剂期:产酸阶段产生的乙酸和丁酸经过乙酰 乙酰~CoA∶乙酸/丁酸∶CoA 转移酶的催化作用分别 形成乙酰~CoA 和丁酰~CoA,乙酰~CoA 在硫激酶的 作用下形成乙酰乙酰~CoA,乙酰乙酰~CoA 再经过乙 酰乙酰~CoA 转移酶的催化作用转化为乙酰乙酸,乙 酰乙酸脱羧形成丙酮.丁酰~CoA 在丁醛脱氢酶和丁 醇脱氢酶催化下,经过两步还原生成丁醇.

2 代谢调控策略 2.1 乙酰~CoA 乙酰~CoA 在溶剂的生成过程中起着关键的作 用,既可以转化成乙酸、乙醇,又可以与乙酰基结合 生成乙酰乙酰~CoA,生成丙酮和丁醇[3] .为了使代谢 流更多流向丙酮和丁醇,发酵过程中可往培养基中添 加乙酸钠,使乙酸钠中的乙酰基与 CoA 结合,生成乙 酰~CoA,提高乙酰~CoA 浓度,生成大量的乙酰乙酰 ~CoA.另外,据Husemann 等[4] 的研究表明乙酸钠还 对丙丁菌细胞内酸碱度有缓冲作用.因此,可以通过 流加乙酸钠实现对代谢流的调控. 2.2 NADH 产酸阶段 NADH 的积累量直接影响代谢的方向, 当NADH 不充足时,乙酰乙酰~CoA 通过乙酰乙酰 ~CoA 转移酶和乙酰乙酸脱羧酶生成丙酮;

当NADH 充足时,乙酰乙酰~CoA 则通过 NADH 的一步步还原 生成丁醇.因此在生产中要着力提高代谢途径中 NADH 的量,以便有足够多的还原力使代谢流流向丁 醇.而NADH 的积累主要在 EMP 途径,通过加大该 过程的代谢流量,可以积累较多的 NADH.因此提高 EMP 途径中起关键作用的 α-淀粉酶的的活力可以实 现代谢流流向丁醇[5] .

3 菌种选育和改造 3.1 建立高产菌株快速筛选方法 丙酮丁醇是小分子挥发性物质,且难以用染料进 行颜色标记,这给高产菌株的筛选带来很大困难. Palmer 等[6] 利用溴甲酚绿平板筛选到产酸能力强的丙 酮丁醇高产菌株. Adler 等[7] 通过平板菌落形态来筛选 高产菌株,菌落直径小、中间呈黑色、产孢子多[8] 、 菌落周边不圆滑的菌株为高产菌株.Bassam 等[9] 根据 菌株淀粉酶活性和丙酮丁醇发酵产量之间存在一定的 关系,用2-脱氧 D-葡萄糖平板筛选丙酮丁醇高产菌. 因为 2-脱氧-D-葡萄糖是常用的淀粉降解阻遏物, 若突 变株可以在 2-脱氧-D-葡萄糖培养基上生长,说明其 解除了淀粉酶的阻遏抑制而促进淀粉酶的过量表达. 上述方法都属于间接的筛选方法,效率较低.根据丙 酮丁醇发酵先产酸后产溶剂及强还原力可将代谢流引 向丙酮和丁醇的特点, 靳孝庆等[10] 建立了简便、 快捷、 高效的丙酮丁醇发酵生产菌复合平板(淀粉降解阻遏 物2-脱氧-D-葡萄糖、 酸碱指示剂溴甲酚绿和还原力指 示剂刃天青三级筛选平板)筛选方法. 3.2 高产菌株的育种 菌种改良是提高丙酮丁醇发酵经济竞争力的关键 手段之一.选育方向的选择决定着选育的成败,菌体 的生长能力和产物量是比较常见的选育指标. 在厌氧发酵过程中,梭菌菌体密度低,产物浓度 低,因此提高丁醇产生菌的耐氧能力是实现菌体高密 度的一个思路[11] .王风芹等[12] 分离得到一株好氧分离 平板上可以良好生长而且丁醇发酵能力较强的芽孢杆 菌(Bacillus sp.),为高密度、高强度丁醇发酵提供了宝 贵的菌种资源.当发酵液中丁醇质量浓度达

5 g/L 时, 发酵就会受影响,超过

10 g/L 时,菌的生长就会受到 抑制[13] ,因此耐受高浓度丁醇菌株的筛选成为提高丁 醇产量的又一个思路[14] . 3.2.1 诱变育种 目前,诱变育种是主要的菌种选育手段.Annous 等[15] 用亚硝基胍做诱变剂,以2-脱氧-D-葡萄糖作为 抗代谢阻遏物筛选到淀粉酶活性大大提高的 C. acetobutylicum BA 101, 其间歇发酵条件丁醇含量可以 达到

19 g/L,比出发菌株提高约 100%.张益钡[16] 用亚硝基胍和甲基磺酸乙........