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BOSTER 博士德生物 Product Information 免疫组化常见问题及对策 免疫组织化学是应用抗原和抗体结合的原理, 检测细胞内多肽、 蛋白质等大分子物质的 分布.

这种方法的特异性强、敏感度高、发展迅速、应用广泛,成为生物学和医学众多学科 的重要研究手段. 作为初次使用本公司的抗体从事免疫组化的客户可能遇到许多问题, 大体 归纳起来, 主要有非特异性着色p着色部位不对p假阳性p无阳性p阳性弱五大类以及其他 一些小问题.现在就以上几点分别说明. 非特异性着色 非特异性着色就是在理论着色区域外的着色,这种着色与背景是有区别性的. 人扁桃体-非特异性染色 人扁桃体-正常染色 ? 主要原因: 1)标本原因,肝肾内源性生物素含量高,与SABC 结合导致非特异性着色,皮肤肺组织胶 原含量高,由于胶原带负电荷,易吸附试剂导致非特异性着色. 2)切片干涸导致的边缘效应. 3)抗体浓度过高. 4)组织在处理中存在出血区域坏死区. 5)洗涤不充分. 6)显色剂氧化,显色时间长. ? 解决方法: 1)一抗应做浓度梯度,选择阳性强,背景好,信躁比高的浓度,作为抗体实验浓度;

二抗浓 度和时间一般不变. 2)稳定实验条件,严格按操作说明进行. 3)在实验中应保持切片始终处于水平状态避免抗体流失,避免切片干涸. 4)在实验中应将试剂覆盖面积大于切片面积. BOSTER 博士德生物 Product Information 5)洗涤要充分,在背景十分深时,可用 37℃预温的 PBS 浸泡 6)防止显色剂的氧化,尤其是配制显色剂使用的容器,最好是灭菌过的;

显色时间应在显微 镜下严格控制. 着色部位不对 着色部位不对有三种情况. 情况一:本是胞浆抗原有着色,但实验结果显示在胞核有着色. 大鼠肺-胞核着色(不对) 大鼠肺-胞浆着色(正常) ? 原因及解决办法: 1)修复时间过长,修复条件十分严苛,这时应降低反应强度,减少修复时间. 2)组织在二甲苯中静置时间过长,这时应更换标本. 3)抗体中含有抗核蛋白抗体,这种情况已不多见. 4)标本原因,标本处理不慎会导致总在同一个地方出现着色. 情况二:本是胞核抗原但显示结果却在胞浆. 大鼠肠-胞浆着色(不对) 大鼠肠-胞核染色(正常) ? 原因及解决办法: 1)核抗原不易暴露,需用热修复或延长修复时间来充分暴露. BOSTER 博士德生物 Product Information 2)蛋白质是在胞浆翻译的,再转运至其他部位,所以出现浆着色也属正常. 情况三:本是胞膜抗原但显示结果却是在胞浆和胞膜都有着色. 小鼠肠-胞浆胞膜着色(不对) 小鼠肠-胞膜染色(正常) ? 原因:蛋白质是在胞浆翻译的,再转运至其他部位,处于转运过程中的膜蛋白有可能显 示在胞浆. 假阳性 如不加一抗也有阳性信号 ? 主要原因: 二抗引起的交叉,球蛋白是一个超家族,哺乳动物种属来缘近的容易发生交叉反应.如:羊 抗兔抗体可与兔标本中球蛋白反应,二抗羊抗小鼠也可与大鼠,小鼠中的球蛋白起反应,尤 其在修复的情况下. 无阳性 大鼠脑-无阳性染色 大鼠脑-正常染色 ? 主要原因: 1)抗原稳定性问题,由于许多蛋白质半衰期短易被破坏,如P53 半衰期只有

30 秒而 PCNA 等抗原稳定. BOSTER 博士德生物 Product Information 2)标本制作过程中烤片时间过高时间过长,标本制作不规范. 3)实验中漏加试剂,实验操作不规范. ? 解决方法: 1)在标本固定中应该严格操作,做到及时固定. 2)在浸蜡时温度不要太高,时间不要过长.一般