PDF《中的应用》

%96%microwell%plate%chip;

%DNA%detection;

%food%poisoning 食物中毒事件是严重影响人类健康的一个重要 公共卫生问题,也可能是生物恐怖中影响公共安全的 最可能手段[1] .2008 年卫生部通过网络直报系统共收 到全国食物中毒报告

431 起, 中毒 13%095 人, 死亡

154 人,涉及

100 人以上的食物中毒

13 起(摘自中国 政府公开信息整合服务平台,http://govinfo.nlc.gov. cn/). 由于漏报等原因,实际的数据可能超过数倍. 其 他发展中国家和西方发达国家的食物中毒事件同样 2010;

30(3)南方医科大学学报(J%South%Med%Univ)

417 ・ ・ 屡屡发生. 我国各类食物中毒中,以食源性致病菌引 起的食物中毒占多数,约占食物中毒总起数的 1/3 以上[2] . 这类食物中毒由于大量活菌随食物进入人体, 侵犯肠粘膜, 引起一系列胃肠炎症状和其它并发症, 称为感染型食物中毒. 潜伏期一般为 8~24%h. 主要致 病菌有副溶血性弧茵、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡 萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌等[2] . 目前国内针对食源性致病菌的检测常规方法仍 停留在增菌和分离培养及生化鉴定这一传统的方 法上,检测时间长(3~5%d),操作繁琐,特异性较低[3] ;

而基于 PCR 或多重 PCR 的分子生物学方法已在部 分实验室应用,但由于通量低,一次可检测的可疑致 病菌仍非常有限,因此无法适应突发公共卫生事件和 生物反恐中的快速应对要求.本研究建立了一种基于

96 微孔板的新型、快速、高通量的 DNA 诊断芯片技 术,该芯片在 6%h 内(不含增菌时间)通过一次实验就 能筛查最多

96 个样品, 并且每个微孔芯片能同时检 测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌 O157:H

7、志 贺氏菌、产单核细胞李斯特菌、蜡样芽胞杆菌、小肠结 肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌等

9 种最常见 的食源性致病菌. 1%%材料与方法 1.1%材料 1.1.1%试剂和菌株

96 孔平底空白芯片盘购自台湾晶 宇生物科技实业股份有限公司,为PS(聚苯乙烯)材质.TaKaRa%Ex%Taq%Hot%Start%Version 购自宝生物工程 (大连)有限公司.Streptavidin-AP(连接有碱性磷酸酶之 抗生物素蛋白链菌素)和NBT/BCIP%(硝基四氮唑蓝 /5- 溴-4- 氯-3- 吲哚基磷酸盐)为美国 Roche%诊断公 司产品. 用于鉴定评价芯片的标准菌株均为来自 ATCC(美国典型菌种保藏中心)和BCRC(台湾生物 资源保藏研究中心)的菌株. 1.1.2%%仪器 Mastercycler%gradient 型PCR 热循环仪为 德国 Eppendorf 公司产品,FS2003 型微孔板芯片点样 仪、MO2004 型微孔板芯片快速杂交仪、DR. %Fluidic% Station 芯片全自动清洗遮蔽呈色仪及 MRC002 型芯 片全自动影像判读仪为台湾晶宇生物科技实业股份 有限公司产品. VITEK%2%COMPACT%30 型全自动微 生物鉴定仪为法国生物梅里埃公司产品.CX-2000 型 紫外交联仪为美国 UVP 公司产品. 1.2%%方法 1.2.1%%引物、 探针的设计、 合成 针对金黄色葡萄球 菌、沙门氏菌、大肠杆菌 O157:H

7、志贺氏菌、产单核 细胞李斯特菌、蜡样芽胞杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、 副溶血弧菌、霍乱弧菌等

9 种食源性致病菌,首先综 合分析相关文献,选择出每种菌的保守基因作为检测 靶点, 选择 16S%rRNA%gene 作为 PCR 阳性质控的检 测靶基因;

然后利用分子生物学软件 DNAMAN%4.0 对GenBank 中登录的相关序列进行系统的同源比对 分析,再利用 Primer%Premier%5.0 和Oligo%6.31 等专业 软件设计出种特异性的引物(5'