PDF《主要食用菌中转基因成分定性 犘犆犚 检测方法》

7 0%乙醇清洗2次, 干燥, 加1

0 0μ LT E( p H 8.

0 ) 溶解. 每个样品设2个重复.也可使用市售的应用于真菌 D NA 提取的试剂盒. 7. 1.

2 能恋呐ǘ扔氪慷炔舛 7. 1. 2.

1 方法1 样品 D NA 用核酸蛋白分析仪测定2

6 0n m 和2

8 0n m 处吸收值, 分别计算 D NA 纯度与浓度, D NA 纯度等于 O D

2 6

0 / O D

2 8 0, 比值在1. 7~2. 0之间较为理想.双链 D NA 浓度( μ g / m L) 等于5 0倍OD260值.

3 犁荦/2

0 7 4―2

0 0

8 www.grainnet.cn 7. 1. 2.

2 方法2 通过真核生物共有的核糖体1

8 S r D NA 基因的 P C R 扩增结果, 判定从样品中提取的 D NA 是否适 合于 P C R 检测, P C R 测试步骤按7. 2规定的方法. 7.

2 定性 壹觳 7. 2.

1 曳从μ逑 检测食用菌中的内源1

8 S r D NA 基因与外源基因采用的 P C R 检测体系见表2.每个样品反应体系 设2个重复( 同时做2管) . 表2 定性 壹觳獠慰挤从μ逑 试剂名称 储备液浓度

2 5μ L反应体系 加样量/ μ L

5 0μ L反应体系 加样量/ μ L

1 0*P C R 缓冲液( 含25mm o l / L 氯化镁) ― 2.

5 5.

0 d N T P s 2. 5mm o l / L 2.

5 5.

0 衩 5U / μ L 0.

2 0.

4 正向引物 反向引物

1 0μ m o l / L 0.

5 1.

0 0.

5 1.

0 D NA 模板

1 0 0n g / μ L~20

0 0n g / μ L 1.

0 2.

0 双蒸水( d d H2O) ― 补至2

5 补至5

0 7. 2.

2 曳从μ逑刀哉盏纳柚 进行 P C R 检测时设立置阳性对照、 阴性对照和空白对照. 阳性对照: 转基因食用菌的阳性质粒或转基因食用菌中提取的 D NA. 阴性对照: 非转基因食用菌中提取的 D NA. 空白对照: 用配制反应体系的实验用水代替模板. 7. 2.

3 曳从θ妊凡问纳柚

9 4℃预变性2m i n.9 4℃变性3 0s ,

5 4℃退火4 0s ,

7 2℃延伸1m i n,

4 0个循环.7 2℃延伸5m i n . 4℃下保存.也可根据不同的基因扩增仪对 P C R 反应热循环参数做相应的调整. 7. 2.

4 依┰霾锏牡缬炯觳 用0. 5*T B E 电泳缓冲液制备2% 的琼脂糖凝胶.将8μ L~1 0μ L 的PCR扩增产物分别与1μ L~2μ L的6*加样缓冲液( 电泳前沿指示剂) 混合后, 在凝胶板上的孔中点样.用分子量大小适当 的DNA M a r k e r做分子量标记.选择合适的电压( 3V / c m~5V / c m) , 电泳时间为5

0 m i n~6 0m i n . 用凝胶成像仪观察、 拍照、 记录与分析.

8 结果判断 8.

1 样品 能脸樘嶂柿颗卸 按照真核生物共有的核糖体1

8 S r D NA 基因的序列设计的引物, 对食用菌阴性样品与待测样品的 D NA 提取液进行 P C R 扩增.均应扩增出1

3 7b p的片段, 否则, 说明提取的 D NA 质量有问题, 或者是 D NA 溶液中存在 P C R 反应的抑制因子, 应该重新纯化或提取 D NA, 直至扩增出该 D NA 片段, 防止检 测中产生假阴性结果. 8.

2 外源基因的检测 如果阴性对照与空白对照未扩增出 D NA 片段, 阳性对照扩出预期的 D NA 片段, 待测样品未扩增 出预期的 D NA 片段, 可以断定待测样品中不含有外源基因, 如果扩出预期的 D NA 片段, 则可初步判定

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0 0

8 www.grainnet.cn 待测样品中含有可疑的外源基因, 应进一步进行确证实验. 8.

3 结果确证实验与结果表述 8. 3.

1 方法1 实时荧光 壹觳夥椒 待测样品外源基因 P C R 扩增阳性结果的, 按照S N / T1

2 0 4中规定的方法执行. 8. 3.

2 方法2 依┰霾锏 能敛庑蚍椒 外源基因 P C R 扩增阳性结果的, 可委托有资质的生物技术公司对扩增产物进行测序, 所获得的序 列与已知的该外源基因相应序列进行比对加以确证. 注:可根据实验室条件任选一种方法进行确证. 8. 3.