PDF《产品信息》

1 产品信息 Thermo Scientific Maxima H Minus 第一链 cDNA 合成试剂盒 #K1651,#K1652 www.

thermoscientific.com/onebio

2 分析证书 使用

100 fg 对照 GAPDH 的RNA 和对照引物进行 RT-PCR 反应,通过在 1%琼脂糖上 进行凝胶电泳和溴化乙锭染色,显示得到足够量的 496bp 大小的产物. 质量授权人: Jurgita Zilinskiene

3 目录 页码 试剂盒组成.4 储存条件.4 产品描述.4 重要提示.5 RT-PCR/RT-qPCR 的对照反应.6 实验方案.6 RT-PCR

6 RT-qPCR

7 合成 cDNA 用于克隆.8 疑难解答.9 参考文献.10

4 试剂盒组成 Maxima H Minus 第一链 cDNA 合成试剂盒 #K1651

20 次#K1652

100 次Maxima H Minus Enzyme Mix

25 μl

120 μl 5*RT 缓冲液

250 nM Tris-HCl (25℃时PH 8.3) ,

375 mM KCl,

15 mM MgCl2,50mM DTT

150 μl

500 μl

10 mM dNTP Mix

50 μl

250 μl Oligo(dT)18 引物

100 μM,0.5 μg/μl

25 μl

120 μl 随机引物

100 μM,0.2 μg/μl

25 μl

120 μl 无核酸酶的水 1.25 ml 2*1.25 ml 贮存条件 所有试剂盒成分都应贮存于-20 ° C. 产品描述 Thermo Scientific Maxima H Minus 第一链 cDNA 合成试剂盒是有效合成 cDNA 第一链 的完整系统.试剂盒采用先进的 Maxima? H Minus 反转录酶(RT) ,该酶来源于 M-MuL V 逆转录酶的体外进化.这种酶在所有的 M-MuL V 衍生逆转录酶中具有最高的热稳定性,并 且缺少 RNase H 活性.Maxima H Minus 第一链 cDNA 合成试剂盒能够在较高温度下 (55-65℃) ,在很宽的总 RNA 量范围内(从1pg 到5μg)合成长达 20kb 的cDNA.其合成 全长 cDNA 的能力超过其它 cDNA 合成系统.由于合成速率的增加,整个反应能在

30 分钟 内完成.Maxima H Minus Enzyme Mix 包含 Maxima H Minus 反转录酶和 Thermo Scientific RiboLock RNase 抑制剂.重组的 RiboLockTM RNase 抑制剂能够有效保护 RNA 在55℃时不 被RNase A、B、C 降解. 本试剂盒提供 Oligo(dT)18 引物和随机引物.随机引物非特异地与模板 RNA 结合, 可用于从总 RNA 中合成 cDNA.Oligo(dT)18 引物选择性的与 RNA 3'

端的 poly(A)退火, 从而只能从带 poly(A)尾的 mRNA 中合成 cDNA.该试剂盒也可用基因特异性引物合成特 定的序列. 合成的 cDNA 可以直接用于各种不同的热稳定 DNA 聚合酶催化的的 PCR 反应,可以 与Thermo Scientific Maxima qPCR 预混液结合使用进行 qPCR 反应,以及用于第二链 cDNA 的合成.

5 重要提示 避免核糖核酸酶污染 RNA 的纯度和完整性对于合成 cDNA 至为重要.RNA 能够被 RNase A 降解, 而在任何 实验环境中都能发现这种稳定的污染物. 本试剂盒中所有成分都经过严格检测, 确保其不含 RNase.为了避免污染,实验环境以及所准备的试剂溶液都必须不含 RNase. 避免 RNase 污染的一般建议: ? 使用确保无核酸酶的实验器具,或者用 DEPC 水处理 cDNA 合成中所用到的反应 管和枪头等. ? 整个实验过程中请戴手套,因为皮肤是 RNA 酶的一个常见来源.同时实验过程 中注意经常更换手套. ? 使用无核酸酶的试剂,包括高纯度的水(如无核酸酶的水,#R0581) . ? 未使用试剂盒时请严格密封保存.在反转录过程中,所有反应管要确保扣严. 模板 RNA 通过标准方法分离的总细胞 RNA 适用于该试剂盒.纯化的 RNA 需确保不含盐分、金 属离子、乙醇和苯酚,以防其抑制 cDNA 合成反应. 对于 RT-PCR,模板 RNA 需确保没有 DNA 污染.在cDNA 合成之前,可先用无核酸酶 的DNase I(#EN0521)去除痕量 DNA. 实验中需要逆转录酶负对照反应.该反应含有除 Maxima H Minus 酶混合物以外的所有 其他 RT-PCR 组分. RNA 样本质量 在合成 cDNA 之前需对 RNA 的完整性进行评估.真核生物总 RNA 能够通过琼脂糖凝 胶电泳后进行 EB 染色来分析检测.如果总 RNA 电泳后 18S 和28S rRNA 条带明显,可认 为RNA 是完整的.28S RNA 条带的亮度大约为 18S rRNA 条带的两倍.rRNA 条带出现任 何拖尾现象都表示 mRNA 存在降解.如果这种情况发生,需重新制备总 RNA 样品.另外, 也可用生物分析仪器(如Agilent 2100)分析总 RNA,该仪器能对 RNA 样本的大致状况, RNA 的完整数(RIN) (2)进行定量.内参基因/目的基因 3'