PDF《1 材 料与 方法》

第 2期 方勤等 : 草鱼呼肠孤 病毒

9 9 1分离 侏的病毒学 特性 分析 所分 离的大 多数 草鱼出血病 病毒毒株, 在形态结 构 与基 因图谱 上具 有相 同特 征,仅个 别毒株在 基 因带 型上有些差 异I s J , 但 未见深入研究.

近 年来, 我们 从湖南长沙分离到一株新的GCR V 毒株(GC R .

1 ) , 该毒株对草 鱼具有强 的致 病性. 为进一步弄清该 病毒特性.进行了形 态学,细胞感染特性, 抗原性与病毒结构 蛋白分析等比较研究.该结果不仅将为 揭示 草鱼 出血病 病毒 各分 离株 间的差异 提供 依据 , 同时 对 草鱼 出血 病基 因工 程疫 苗研究及 草鱼抗病育种的毒株筛选具有十分重要的意义.

1 材料与方法

1 .

1 材料 实验所用 C I K( 草鱼肾细 胞)由本 实验室保 存,传代

1 5 6代.F HM( 肥头鲤细胞) 由法 国马赛地 中海医科大 学分子病毒学系Ho u s s a m A t t t ~ u 博士馈赠, 传代

1 4 5代.B F

2 ( 蓝鱼细胞) 与EPC(鲤鱼上皮 瘤细胞 ) 细胞 系 由德 国慕尼 黑大学动 物学院SEss―bauer博士馈赠, 传代次数分别为

1 6

8 、

1 7 5代 .草鱼 呼肠孤 病毒 湘南 邵阳株L

5 ( G C R V一873)本实验室 分离, 一3

0 ℃保存 ;

免抗 G C R v

8 7

3 抗体 由本 实验室制 备, 一3

0 1 2保存 .草鱼呼肠孤病毒湖南长沙株(GCRV一

9 9

1 ) 由湖南农业 大学 提供 【

9 1 .

1 2 方法1.2.1细胞培养、 病毒感染与中和实验 草鱼肾细 胞系( C I K) 的细胞培养及病 毒接种传代与滴度测定 按本实验室常规方法进行【 .采用本实验室常 规固定病 毒量 与倍 比稀释血清法进行 中和效价测 定.实验设置 3组 重复, 于24孔 C a s t 板 中进 行. 同时设病毒感染 与正常细胞 对照各一组 按Reed―Mu e c h法 计算

5 0 %中和滴价 .

1 2 .

2 G C R V一991毒株的分离及免疫 电镜观察 本 实验采 用差异离 心法 提取病 毒 粒子 , 采用 C s C

1 密 度梯 度离心 (

2 0 %、

3 0 %、

4 O % 、

5 0 %) 获得 纯化的病毒蛋白, 分带收集纯化的样品. 在双蒸水 中透析

2 4 h 除去样品 中的 C s C I .免疫复合物的制备按 如下方 法进行: 取一滴兔抗 GC RV m 抗体, 与 9倍体 积的 G C R

9 l 病 毒培 养 液混 合,37℃保温lh,于12000g离心

1 0 mi n , 沉淀溶于适量无菌双蒸水中, 上述样品 经2%R T A负染 F 一700FA型电镜下观察结果

1 2

3 病毒核酸与结构蛋白的SDS-PAG E G C RV的核酸提取按实验 室常规方法进行【

5 1 , 采用 I e a mml i 系统 l 对GCR V 核酸进行分离: S D S - P A G E浓度为7%, 在30mA 条件下电泳

1 2 h T .E B 染色后在紫外下观察结 果.纯化的病毒蛋白与 2* 样品缓冲液(0.0625mo l / L Tr i s . HC L p H6

8 .

2 % S D S ,

5 % p巯基乙醇 ) 混匀后,95℃变性5mi n , 于12%SDS ― P AG E凝胶进行 电泳分离.考 马斯 亮蓝 染色 后观察结 果l1.2结果

2 .

1 G C R V . 的细胞感染与中和滴定 本实 验采用四株水生动物细胞(CI K, F HM, B F 2及EPC)与2株哺乳动 物细胞 ( B HK. Ve r

0 ) 对GC R V

9 9 l 进行 了细胞敏感性 比较实验 .病毒感染细 胞后 2―3 d , 可观察到 C I K, F HM 细胞产生明显的 细胞病变作用(Cytopathiceftect,CPE) , 而BF2.EPC细胞无任何病 理变 化.将原代培养的细胞病 毒悬液进行传代培养, 发现 G C R v

9 . 在CIK. F HM 细胞上传代

2 ―3次, 病毒滴价趋于稳定, 而在 B F