PDF《ELISA 的种类及原理》

本手册由中国免疫学实验网( www.

immuexp.com )转自 Proteintech Group. 概述.1 ELISA 的种类及原理.1 直接 ELISA.2 间接 ELISA.3 夹心 ELISA.4 竞争抑制 ELISA.7 ELISA 实验的操作.10 将抗原或抗体吸附到固相载体上

10 封闭

12 加入待检样品以及后续试剂.12 温育

12 洗涤去掉游离未结合的反应物.13 加入酶检测底物

13 结果的判读.13 ELISA 实验常用试剂详解

13 ELISA 常见问题及分析.16 本手册由中国免疫学实验网( www.immuexp.com )转自 Proteintech Group.

1 概述

1971 年瑞典的 Engvall 等人分别以纤维素和聚苯乙烯试管作为固相载体 吸附抗原/抗体, 建立了酶联免疫吸附测定 (Enzyme Linked Immunosrbent Assay, 简称 ELISA) , 后来人们改用板式反应孔进行 ELISA, 大大地提高了实验通量. ELISA 实验具有极高的灵活性, 实际操作中人们可以根据自己的需要以及手上 已有的材料进行灵活的组合而进行各种可样的 ELISA 进行反应测定,另外 ELISA 实验中的相关试剂和耗材都已经商品化,所以 ELISA 被广泛地应用于 生物学的各种研究中.通过 ScienceDirect 搜索可以看出,1975 年只有

1 篇文 献是研究 ELISA 的,

1976 年为

6 篇, 但是到

2010 年这一数字上升到

1994 篇, 历年文献累计达

29490 篇,足见其研究之广. ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记.结合在固 相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性, 酶标记的抗原或抗体既保留其 免疫学活性,又保留酶的活性.在测定时,受检标本(测定抗体或抗原)与固 相载体表面的抗原或抗体起反应. 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体 复合物与液体中的其他物质分开. 再加入酶标记的抗原或抗体, 也通过反应而 结合在固相载体上 . 此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例. 加入酶反应的底物后, 底物被酶催化成为有色产物, 产物的量与标本中受检物 质的量直接相关, 故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析. 由于酶的催化效 率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度. ELISA 的种类及原理 关于 ELISA 的分类众说纷纭,不同文献从原理或操作上都有不同的分类 意见.这里先将 ELISA 分为以下四大类,然后针对每一类进行详细讲解:(1) 直接 ELISA;

(2)间接 ELISA;

(3)夹心 ELISA;

(4)竞争抑制 ELISA.其 它的 ELISA 都隶属于这四类 ELISA 或由这四类 ELISA 组合衍生. 本手册由中国免疫学实验网( www.immuexp.com )转自 Proteintech Group.

2 直接 ELISA 直接 ELISA 是所有 ELISA 中步骤最简单的一种, 其方法是将抗原按一定的 比例用包被缓冲液稀释好包被到固相载体上, 包被完成后简单洗涤, 再加入封闭 液,封闭结束后再次洗涤除去多余封闭液,加入稀释好的特异性的酶标抗体,37 ℃温育一小时或 4℃温育过夜后,洗涤除去多余的抗体,加入底物显色并判读结 果.最后显色的深浅与加入的酶标抗体量成正比.直接 ELISA 的原理如图 1: 图1直接 ELISA 原理 本手册由中国免疫学实验网( www.immuexp.com )转自 Proteintech Group.

3 一个很常见的直接 ELISA 实例就是检测单抗亚型,实际操作中可以将经 过亲和纯化的单抗包被在酶标板上, 封闭后加入酶标分型二抗, 最后加底物显 色即可. 此外用直接 ELISA 可以检测血清种属, 也有人用直接 ELISA 进行单克 隆抗体制备中的初步筛选. 不过虽然直接 ELISA 操作很简单, 步骤也比较简练, 但是其应用范围还是非常有限的, 一个重要的原因是这种 ELISA 中只经过了一 步信号放大(酶的放大) ,所以其灵敏度不是很高,另外其测定的对象也非常 有限,只能测定酶标记的分子. 间接 ELISA 间接 ELISA 的步骤与直接 ELISA 步骤前面的部分基本一致,不同的是, 间接 ELISA 中与包被好的抗原结合的不是酶标抗体,而是非酶标的,另外再 引入第二种抗体(即二抗) ,二抗是经过酶标的,它可以与第一种抗体(与抗 原直接结合的抗体,即一抗)特异性结合.最后加入底物显色并判读结果.当 二抗的浓度一定的时候, 最终的显色结果与一抗的量是正相关的. 间接 ELISA 的操作如图 2,同直接 ELISA 将抗原包被到酶标板上,洗涤后封闭,再次洗涤 后加入稀释好的待检抗体(一抗) ,温育后洗掉未与抗原结合的一抗,再加入 酶标二抗,再次温育,此时酶标二抗即可与一抗结合,最后加入底物显色. 由于二抗一般为多抗,因此一个一抗分子上可以结合多个二抗分子,同 时一个二抗分子上可以标记上多个酶分子,所以当待测抗体为多抗时 (可以由 多个一抗分子与抗原结合) ,信号经过两步放大,最终提高了检测的灵敏度. 另外由于二抗制备比较容易, 而且很早就开始商品化,所以操作者无需要将一 抗进行酶标,大大缩减了工作量.在检测抗体的效价、血清的效价以及单克隆 抗体的筛选过程中,间接 ELISA 都是非常重要的实验过程,在临床诊断中, 间接 ELISA 也是检测标志性抗体的重要手段. 本手册由中国免疫学实验网( www.immuexp.com )转自 Proteintech Group.