PDF《照品的制备》

电话: 020-62789135, E-mail: guo. fang86@163.com 通讯作者: 吕建新, 教授, E-mail: ljx@wzmc.ne;

高基民, 教授, 博士生导 师, E-mail: jimingao@yahoo.com ・ ・955 南方医科大学学报 (J South Med Univ) 第31卷 性和特异性 [ 2-3 ] .近年来, 人们对结核分枝杆菌培养的滤 液进行了深入的研究, 分离出了多种分泌蛋白, 其中的 CFP10具有良好的免疫原性, 而且为结核分枝杆菌和牛 结核分枝杆菌所特有, BCG及非致病分枝杆菌缺乏 [ 4-5 ] , 因此CPF10可以作为诊断结核分枝杆菌感染的特异性 靶标.时间分辨荧光免疫分析技术 ( TRFIA ) 是近10年 来发展的一种新型的超微量标记分析技术, 该技术具有 灵敏度高 ( 10-18 mol/孔) 、 操作简便、 易自动化、 标准曲线 范围宽、 不受样品自然荧光干扰、 标记物制备简便且稳 定、 无放射性污染、 多标记等特点.本研究通过基因工 程技术制备双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析法检测 CFP10的参照品, 为下一步研制该试剂盒, 并进一步将 TRFIA应用于临床结核病的诊断打下初步基础.

1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 质粒和菌株 结核分枝杆菌H37RV标准株全基 因组由新疆石河子大学惠赠;

菌株DH5α及Rosetta均购 自北京全式金公司;

质粒pET24b、 pET21a-SA、 pET24b-SA为本室保存. 1.1.2 主要试剂和仪器 PCR 试剂、 Bam HI、 Nde I、 EcoR I、 Hind III、 Xho I限制性内切酶及连接酶均购自 TAKARA,Ni-NTA 柱填料购自GE Healthcare, Western blotting 一抗, 包被抗体、 被标记抗体均为 CFP10单克隆抗体, 购自Biodesign, 辣根过氧化物酶标 记的山羊抗小鼠IgG购自北京鼎国公司, DAB显色试 剂盒购自武汉博士德公司, PVDF膜、 浓缩离心管均购 自Millipore, 抗体标记试剂盒购自Wallac.DR-M6601 时间分辨荧光免疫分析仪、 洗板机、 振荡仪购自广州市 达瑞抗体工程技术有限公司. 1.2 方法 1.2.1 引物设计 根据 CFP10 的基因序列 ( GenBank: FJ014498.1 ) 及所选载体的多克隆位点, 设计引物如下 (引物合成由上海英骏公司完成) : 上游引物 P1: CGGGATCCATATGGCAGAGATGAAGACCGA, 引入BamH I 和Nde I 酶切位点;

下游引物 P2: CGGAA TTCGAAGCCCATTTGCGAGGA, 引入EcoR I酶切位 点;

下游引物 P3: CCGCTCGAGGAAGCCCATTTGC GAGGACAGCGCCTGCTGCTGCTCCTCGTCGGC CCGCGAGTATTGGACGC, 引入Xho I酶切位点. 1.2.2 目的基因的扩增 以结核分支杆菌标准株H37RV 全基因组为模板分别加入上述PCR引物Pl、 P2或P

1、 P3 进行扩增, 1.5%琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果. 1.2.3 重组质粒的构建及鉴定 P

1、 P2扩增产物切胶回 收后, 与pET21a-SA载体同时进行Nde I和EcoR I双酶 切;

P

1、 P3扩增产物切胶回收后, 与pET24b-SA载体同 时进行BamH I、 Xho I双酶切, 与pET24b载体同时进行 Nde I、 Xho I双酶切.将目的片段与相应载体连接后, 转化DH5α感受态细胞.于卡那霉素平板 ( pET24b、 pET24b-SA ) 和氨苄青霉素平板 ( pET21a-SA ) 培养

14 h, 分别挑取单克隆菌落, 加入T7上游引物和CFP-10下 游引物P2或P3进行菌落PCR鉴定, 将阳性克隆提取质 粒再进行双酶切鉴定, 酶切成功者送测序 (测序由上海 英骏生物技术公司完成 ) . 1.2.4 重组蛋白的表达 将测序正确的质粒转入大肠杆 菌Rosetta,

37 ℃培养至OD600=0.4~0.6时, 加入终浓度 为1 mmol/L的IPTG, 诱导4 h后, 离心收集菌体, 12% SDS-PAGE 检测蛋白表达.重组质粒 pET24b-SA- CFP10 表达产物为 SA-CFP10 ( SA 在CFP10 N 端) , pET21a-CFP10-SA 表达产物为CFP10-SA( SA 在CFP10 C端) , pET24b表达产物为CFP10.重组蛋白表 达形式分析: (