PDF《Genloci pGK1.0(Neo ) vector》

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(本试剂盒中不提供,请自行合成) . 4. 电转染靶细胞(推荐) 转染前进行质粒大提(去内毒素) ,确保质粒浓度≥1μg/μl 浓度,再按照转染仪器或转染试剂说明书取 合适的量进行转染操作,推荐使用 Celetrix 细胞电转仪(型号:CTX-1500A),贴壁细胞需 3x106 ~5x106 数量,悬浮细胞需 5x106 ~8x106 数量,转染体积 120ul,需质粒量 6-8ug. 5. Cruiser? 筛选阳性克隆 将靶 pool 细胞经过有限或梯度稀释后,在96 孔板中进行单克隆培养,如果靶细胞是悬浮细胞,推 荐使用 Cell Plaza? (Cat.No.: GP5036)培养细胞,待96 孔板长至

10 倍镜下视野 1/4 面积时,可转移至

48 孔板扩大培养,待48 孔板长满后,可取

48 孔板一半的细胞提基因组,推荐使用 Genloci TNA 抽提试剂盒 (Cat.No.: GP0155,GP0156).然后通过 PCR 和核酸内切酶初步筛选阳性克隆,推荐使用 Genloci Cruiser? Enzyme(Cat. No.:GP0104,GP0105,GP0106)或Genloci Cruiser? 基因敲除检测试剂盒 (Cat.No.:GP0102,GP0103)或Genloci Ex-Cruiser 基因敲除检测试剂盒(Cat. No.:GP0402, GP0403) ,对Cruiser 筛选后的阳性克隆进行测序分析,对于两个亲本不同 KO 情况的再进行 TA 克隆检测. Genloci pGK1.0(Neor ) vector Protocol No. PT161214-4 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc. 7/9 V. FAQ Q-1:靶位点设计有哪些注意事项 A-1:目前有几个在线设计软件,我们推荐使用 Zhang Feng lab:http://crispr.mit.edu/,该软件会对每一个 潜在的靶位点打分,并告知是否存在脱靶现象.在设计 oligo 序列时,需要特别注意 Guide 序列第一个碱基 必须是 G,如........