PDF《郑官增叶冬桂朱智荨》

f f ~ I b 第14卷第1 期1999年 3月中国病毒学V1 ROL0G I CA S I N I CA V0 l

14 No

1 M a r l

99 9

1 O株 水痘 带 状疱 疹病毒的分 离鉴 定 与生 物 学特 性郑官增 叶冬 桂朱智荨'

(浙江省 台州市 卫 生防疫 站.

浙江 台州

3 1

7 0

0 0 ) ( 浙江省台州医院,浙江台州31'

7000)(浙江省卫 生 防疫 站,杭州310009)R;

'

皮}

7 上'

摘要用VetoE6细胞 从12倒 水痘 及带 状疱 疹病^水 疱液中分 离到l0株 病毒,分离阳性率为833%.1 0株 病毒均 具 有使 感染细胞圆缩 、 融合、脱落等典型的vz v 局灶 性细胞病变(CPE) 特点,CPE随 着传 代次 数增 加 而加 快用带状疤疹恢 复期病^血清作 闻接 免疫荧光染色镜检,可见典型的 感染 细胞 核 内荧 光块 .1 O株病 毒感 染细 胞制 成 的抗 原片. 检测5倒 带状 疱 疹病 ^ 急性 期及恢复 期 血清 . 荧光 抗 体滴 度均有

4 倍 以上增 高.Vz v对Vero细胞 敏感 ;

对沙鼠肾, 胎兔肾.胎豚鼠肾、 肺、脾原代 单层细胞 不敏 感;

对乳 小 白鼠 不敏 感.毒种 在一2

0 ℃保存一周内死 亡;

但在30%脱 脂牛 奶、20%小 牛血 清及

1 0 % 山梨醇 E a g l e '

s 液中, 蔽 体或 真 空冷 冻干 燥一1

0 0 ℃可保 存二年上.关键 词水痘带状 痘疹 病毒.分离,鉴定 , 生物学 特性 '

, … . . 一水痘带状疱 疹病毒(VZ V) 是 引起 人类 水痘、带状疱疹的病原.为了寻找水痘带状疱疹疫苗病 毒株及研制疫苗 的基质细胞, 我们 自1994年 以来, 用Ve r o ― E

6 细胞 床边接 种法 , 从 2例 水 痘和 l 0例带状疱疹 病人水疱 液 中分 离到 l O株VZ V, 并 对其 生物学 特性 作 了初步 探索研究 . 现报 告如下 :

1 材料 与方法11标本

1 2 例 标本 均 用无 菌注 射 器吸取 病^出疱后

2 ~1

0 d的 水疱 渡.立即送 病毒 实验室接 种12细胞 Ve r o . E

6 及Veto传 代细 胞 由朱智 勇 教授 提供 ;

2 B S和HL F二倍 体 细胞 分别来自中 国药 品 生物 制 品检 定所 和 中科院 上海 细胞 所,本室 传代 保存 ;

沙 鼠肾 , 胎兔肾.胎豚鼠肾、肺、脾原代细胞均本 室 自制 生长浪为

1 O %新生小牛 血清 Ea g l e '

s 液.13病毒分离 … 生 长成 单 层的 Ve t o ― E 细胞 倒去 生长 液.每5mL小方 瓶单 层 细胞 接 种标 本0l~0 5mL ( 视标本量 而定 ) ,

3 6℃吸附2h后 . 倒 去标 本液 . 用Eagle'

s液洗一次.加5mL维持液,置36℃ 温箱 每 日观 察CPE.每隔2~3 d揍液 一次 .

7 d后如 无CPE出现 则进行 盲传, 盲传3次 仍无CPE则视为 分离 阴性 .

1 4 带状 疱疹 病 人急 性期及恢 复期 双 份血 清急性期 血清采自病 ^ 出疱 第1~2 天,恢复期血清 采 自出疱 后l0~1

4 d皮损 结痂 大部 分 脱落 的病 人血 清.15间接 免疫 荧光 测定 出现 CP E后的 细胞 , 用002%EDT A+0

1 %胰酶消化液 分散细胞 . 取小量细 胞 悬液 滴在 玻 片上 干燥 , 玲 丙酮 固定 l 0m i n后,1:20稀释 带状疱疹恢 复期 病^血清37℃ 结合45ml n , 洗涤、 峨干后加 甘油 封片.用荧 光显 微镜 观察 细 胞核 内荧 光染 色情 况.1.6CPE观察 接种标本后,每天观察 对照细胞有无自然 脱落等非特异性 细胞死亡现象及VZ V特 异性 牧稿 日期 :1

9 9 '

7 ―1

0 ―2 -

4 . 修回日期 :1

9 9 8―0 6―2

4 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国病毒学第14卷 C P E . + 示CP E在25%下, + 示CPE为

2 5 ~5

0 %. 卅 示CPE为

5 0 ~7

5 %.

1 .

7 v z v某些生物学 特性 的研 究VZ V 经Ve r o细 胞连 续 3次 带毒传代 . C P E过 ,用超 声波细胞粉碎 器裂 解感 染 细胞 ,

5 0

0 r / mi n离心沉淀 . 上清波为毒种 … .

2 结果2.1病毒分离情况 用Ve t o E 6细胞 从12例水痘或 带状 痘疹病人疱液 中分离到

1 0株病 毒, 阳性 率为83.3%. 其 中男 6例, 女 4例 .水痘病 人 1例, 带 状疱 疹病人9例.病人年龄 在5~7 2岁, 平均

3 1

2 岁.标本采 集时 间在 出疱后

2 ~1

0 d , 平均

5 4 也8份标本在接 种 细胞

3 ~8 d ( 平均

6 d ) 出现 '

+~+ T C P E.2份标本在细胞带 毒传第二代后 出现 + C P E, 结果 见表

1 . 表1标本 来 源及 病毒分 离情 况Ta b l e

1 So u r c e o f s a m p l e a n d i s o l a t i o n 0f n

2 .

2 C P E特点细胞 开始表现 为肿胀 、 圆缩 、 聚集, 最后 出现多个细 胞融 合、脱落, 如图

1 、 图2.2.3感染细胞间 接免疫荧光染 色特 点经间接 免疫 荧光染色镜检, 可见感染细胞 内典 型 的核 内荧光 块, 充满整 个细 胞核 , 细胞浆 内 无任 何荧光颗粒,如图3.2.4病人双份血 清间接 免疫 荧光抗 体滴度 将 出现 C P E 卅 的细胞制成抗原 片, 用 5侧带 状疱 疹病 人恢 复期及 急性期 双 份血 清作 间接免疫 荧光 染色, 结果恢复期病人抗体滴度均 比急性 期增高 4倍 以上, 结果 见表

2 .

2 .

5 VZ V部分生物学特性 的研 究25.1VZ V. 在传代 细胞 、 二倍体 细胞 及原 代细胞 上适应 情况 将VZVI 毒种接 种于Vero―E,Veto传代细胞 ,

2 B S和HLF二 倍体 细胞,沙鼠肾原 代细胞, 胎兔肾原 代细胞, 胎豚鼠肾、 肺、脾原 代单 层细 胞.结果Ve t o及Ve t o ― E 传代细 胞接 种5~7 d后 出现 典 型的 Vz V C P E;

2 B S 、 HL F及其 它原代细胞 经盲 传三代未见 C P E, 括取细胞做 荧光染色也未 见阳性细胞 . 维普资讯 http://www.cqvip.com 第1期郑官增 等:10株水痘 带 状疱 疹病 毒 的分离 鉴 定与 生物 学特 眭13图1vz v致Ve t o E 6细胞 圆缩 、 融台 、 脱 落病变 ( 放太

4 0 0倍) Fi g.

1 VZV C S U ~S t y p i c a l Ve t o c e l l da ma ge s s u c h a s r o u n d e d a t

1 d… h r i l l c d .r u s k i n a n d f a l l o u t( x

4 0

0 ) 图2VZ V 致ve r . - E 细胞 圆缩 、 磁台病变(放大i00倍 ) Fi g

2 VZV c a u s e s t y p i c a l V… c e l l d a n ~g e s s u c h a s m… d e d d h r i… I l e d wd ] a st u ~ i o n (*1

0 0) 图3VZ V感染 细胞桩 内 黄光抗 原Fi g

3 Ant i g e n . f l u or ~c e t * c e i n VZV ― i nf e c t e d c e l l n uc l e u s 维普资讯 http://www.cqvip.com

1 4 中国病毒学第14卷

2 5

2 VZ VI 在Ve t o细胞内生长 后的TCI D

5 D VZ V} 在Ve t o细胞上传至CPE达 + 后,用24孔 一 次性 使用塑料 细胞培养板,每孔接种经不同处 理后病毒液01mL,

3 6℃烛缸法培养l4d观察 C P E及荧光 染色 阳性 细胞 .结果 感染 细胞 培养 液或感 染 细胞 与培 养液 经超 声 波击 碎(8r ai n后),经8000r/rai n离心30r ai n , 上清液TC I D

5 0 均是10;

感染细胞与培养液经超声波击碎(

8 r ai n ) 但不离心 , 直接测 TCI D5 o 是10一. 衰2带状疱疹 病 人双份 血清免 痤荧 光抗体 滴度Ta bl e

2 Tke r o f I 帆uno口u o㈣ e n L e a n 6b o d y o f f a c e a n d r e c o v e r i n g n e. {p a t i e n t s wi t h h e r p e s= ∞ t e r : 上排为急性 期血 清, 下排 为恢复 期血 清. Th e a b o v e】 a ~ u t e s t a ge s e r a .t h e u nd e r ne a t h I s r e c o v e r i n g … r a

2 .

5 3 vz v. 在Ve r o细胞上的生 长特2531VZ V 毒种接种 ve m 单 层细胞 后, 第 5天 开始 出现 C P E + ;

带 毒传代 后,第3天 为_r+ ,第5天为 卅 ;

C P E随着传代次数 增加 而加快.

2 5

3 2 将盖玻片放入细胞瓶内,培养成单层细胞后,接种毒种 . 待出现典型的CPE后,取出盖玻作荧光染色镜检,结果荧光性细胞仅出现在有CPE的细胞核内.

2 5 .

4 VZ V. 在乳长 爪沙 鼠, 乳小白 鼠中适应情况 分别将 2日龄乳 长爪 沙鼠( 8只) 乳小白鼠(7只) , 每 只脑 内接 种毒种0.02mI , 腹腔 接种05m L1 第 5天 开始逐日观 察其发病情况,并每: t 取 1只 鼠脑 、 肺、脾、 肾冰冻 切片, 间接免疫荧光 法动态检 查VZ V抗原 ;

结果试 验组乳 鼠均 未 发病 , 也未检测到 阳性抗 原25.5VZ V 细 胞培 养 上清 液病 毒感染 性测 定 4株 VZ V 分别 接种Ve r o细胞,待CPE达 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 1期 郑官 增等:l0株水 痘 带状 疱疹 病 毒的分 离 鉴定 与生 物学 特性

1 s 卅 后,取培养 液4000r/mi n离心10mi n , 吸上清液接种于Ve m― E 单层细胞;

逐日观 察细胞病变持续

6 d , 4株病 毒感染 细胞均未 出现 C P E+ 经 带毒传代 一次后+ 均 出现 +~十. CPE.

2 .

5 6 vz v 毒种保存5株 毒种分别接种Ve r o细胞,CPE达 卅 时倒去培养液,加入含5% 蔗糖,l0%小牛血清,50%甘 油的Eagle'

s液.刮下细胞 , 一2 0℃ 保存一个月后VZ V 全部死亡.后改为30%脱脂 牛奶,20%小牛血清,l0%山梨 醇Eagle'

s保 存液,一部分作真空冷冻干燥一100℃保存 ;

另一部分 直接保 存在 一1

0 0℃低 温冰箱 内.上述两种保存方法 , 二年后 vz v仍存活.3讨论3.1一些 学者认为Vz V 最 敏感 的 培养 细胞 是人胚肺纤维母细胞、羊膜 细胞.本 研 究用 Ve t o - E 6细胞分 离VZ V, 病 毒分 离 阳性 率高达

8 3

3 %.其原 因可能 与 以下几个 因 素有关 :一是VZ V 对Ve m― E 6细胞 比其它细胞敏 感;

二是采 用床边接 种法 , 标本未经冷冻 保存 . 病 毒滴度 高, 感 染力强 .2例标本未分离到病 毒主要 原 因是所 取水疱液 量太 少,且病 人用过 干 扰素 、 病 毒唑 、 阿昔 洛韦等抗病毒药物 .

3 2 本次分 离到的

1 0株病 毒.8株 在标本 接种 后 的第 一代 就 出现典 型的 vz V C P E, 全部病 毒株 经 3次细胞带 毒传代后 出现 卅 C P E .感 染细胞 制成抗 原片, 用 5倒 带状 疱疹 病 人双份 血清 检查 , 恢复 期 比急性期抗体滴 度均 有 4倍 以上 增加 .荧光染色 可见感 染细胞 具 典型 的核 内荧光抗原 , 细胞浆 内无 任何 荧光颗粒 .上述 检 测结 果均 符合 VZ V 典型 特征_ 】 J .结合 临 床诊 断+我们认 为本次分离到 l O株病毒确系水痘带状 疱疹病毒.3.

3 vz v 等毒株 部分 生物 学特性研 究结果有 如下特点 : (

1 )vz v 对Ve r o及Ve t o E 细胞高度敏感 . 是分离及研 究vz v 的首 选细胞株.(2)VZ V在2BS和 HL F二倍体细胞上难 以适 应:VZ V 对胎 兔肾, 乳 长爪 沙 鼠肾+ 胎辑 鼠肾、 肺、脾原代细胞不敏感 ;

VZ V对乳长 爪沙 鼠、 乳小白 鼠亦不敏感. (

3 )从CP E及盖玻 片小培 养荧光染色特点分 析,VZ V 产生 明显 的局 灶性 细胞病 变;

病毒 在细胞 ........