PDF《免疫组化试剂盒实验操作步骤》

1 免疫组化试剂盒实验操作步骤 仪器、设备 移液器、免疫组化笔、微波炉或高压锅、计时器、孵育湿盒、染色架、盖玻片、光学显微镜、洗瓶等.

溶液配制 PBS 溶液配制;

EDTA 组织抗原修复液及 DAB 显色液使用详见本说明书操作步骤. 实验温度 15-28℃ 实验步骤 1.脱蜡水化 1) 石蜡切片置于新鲜的二甲苯中,浸泡

15 min *2 次;

2) 去除多余的液体后,置无水乙醇中,浸泡

3 min *2 次;

3) 去除多余的液体后,置95% 乙醇中,浸泡

3 min;

4) 去除多余的液体后,置85% 乙醇中,浸泡

3 min;

5) 自来水冲洗

1 min;

6) PBS 溶液冲洗

3 min *3 次. 2.加热 EDTA 抗原修复液(试剂 1,采用微波进行抗原修复) 1) 将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯(或修复盒)中的耐高温塑料切片架上;

2) 加适量的修复液 1* EDTA 抗原修复液,(溶液 1,用纯净水稀释

20 倍后)于烧杯中,液面要浸过切片组织一定高度;

3) 微波炉先用高档加热使液体沸腾,当加热至沸腾时调到中档,此时开始计时,修复时间一般为

20 min,此过程中勿使 组织干片(修复液要足量);

4) 将烧杯从微波炉中拿出,放入冷水中冷却降温;

5) 当修复液降至室温后取出玻片,用PBS(PH7.4)冲洗

3 min *3 次. 注意: 1) 抗原修复时,修复液务必保证切片始终浸泡在液体内,一般情况:修复液的量为

800 mL/1 架-1500 mL/3 架;

2) 取出玻片,用PBS 冲洗,切勿对着组织冲洗,以免弄破组织. 3.阻断内源性过氧化物酶 1) 用吸水纸擦干玻片,免疫组画笔在组织周围画圈;

2) 将3% 的过氧化氢(试剂 2),滴加

100 μL 到切片组织上以阻断内源性过氧化物酶,室温孵育

15 min;

3) PBS 冲洗

3 min *3 次.

2 4.封闭 用吸水纸擦干玻片,滴加正常山羊血清(试剂 3),室温封闭

15 min,以减少非特异性染色. 5.一抗孵育 1) 用吸水纸擦干玻片组织周围的液体;

2) 滴加单克隆抗体(试剂 4)100 μL,如果做阴性对照实验,就在对照组的组织上滴加 PBS 作为阴性对照,置于湿 盒中室温孵育 1h 或4° C 孵育过夜. 6.复温 1) 样本 4℃过夜从冰箱拿出后需在室温下孵育

15 min 复温(抗体孵育为 4℃过夜选用此步骤,如室温孵育直接进入下一 步清洗);

2) PBS 冲洗

3 min *3 次. 7.加聚合物辅助剂(试剂 5) 1) 吸水纸擦干切片后滴加试剂 5(Polymer Helper),室温或 37℃孵育

20 min;

2) PBS 冲洗

3 min *3 次. 8.二抗孵育 1) 吸水纸擦干切片后滴加试剂 6(Polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG),室温或 37℃孵育

20 min;

2) PBS 冲洗

3 min *4 次. 9.显色 1) 甩去 PBS 液,吸水纸擦干切片;

2) 每张切片滴加新鲜配制的 DAB 显色液

100 μL(试剂 7:试剂 8=1:49 比例配置),孵育 3-5 min,光学显微镜下观察 染色结果,切勿显色过深;

3) 显色后用自来水冲洗切片终止显色. 10.复染 加100 μL 的苏木素(试剂 9)复染,孵育

30 s-1 min 左右,自来水冲洗

5 min. 注意: 依据作用的苏木素染色液强度和孵育时间长短,对比染色结果导致细胞核呈现淡蓝到深蓝颜色的反应,而过染或者不足都 可能影响正确结果的判断. 1) 将切片放入 70% 酒精,浸泡

2 min;

3 11.脱水、透明、封片 1) 将切片放入 70% 酒精,浸泡

2 min;

2) 将切片放入 80% 酒精,浸泡

2 min;

3) 将切片放入 90% 酒精,浸泡

2 min;

4) 将切片放入 95% 酒精,浸泡