PDF《中国病毒学》

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f 第1

2 卷第

1 期l997年 3月中国病毒学V[ROL OGI CA S I NI C A f

7 .

I

2 No.

1 M a r .

1 9

97 用猴艾滋病 D型逆转录病毒 筛选抗艾滋病 药物 实验模型 的建立 及应 用'

郑'

永唐 提要以药物对合胞体形 震/650223//(中国科学院昆明动物研究所.昆明)J之,t成的 抻翻 和对 细胞的毒性作 为检测指标 . 应用虢艾滋病 D塑 逆转 录病 占・7毒(SRV) /

1 L a j i 细胞 系统 建立 了体 外筛选抗 艾滋病药物 的实验模 型.A Z T和 天花粉 蛋白可显 著地 抑制 S RV诱 导的合胞体形 成, 它 们的选 择指数 ( s

1 ) 分别 为数

1 3

5 0 0和8812.用该 模型 筛选 了46Syndrome , AI D S ) 是 由人免 疫缺 陷病 毒(Hu ma n I m mu n o d e f i c i e n c y Vi n ~ s ,HI V) 引起 的传 染病 . 由于其流行广、 病 死率极高 . 寻找新的抗艾滋病 药物成为 当务之急 .筛选抗艾滋病 药物 . 主要 采甩 HI V/ 人 T淋巴细胞系的模型进行体外筛选.由于必须在特殊实验室进行, 所 以不少学 者探 索 甩动 物逆转 录病 毒,如山羊关 节炎 一脑 炎病 毒((:AEv) . 猫 白血病 病毒(FIV) , 猴免疫缺 陷病毒( S I V) , Vi a n a 病毒, 马传染性贫血病毒( E I A V) 及牛免疫缺陷病毒 ( B I V) 等, 作 为模型. 来进行药物 筛选和研究药物的作用机制l I . 猴 艾滋 病(SAI D S ) 是研究人艾滋病的主要动物模型 】.SAI D S的病原体有猴 艾滋 病D型逆转 录病 毒(Simi a n A I DS t y p e D r e t r o v i r u s ,S R V) 和猴 免疫 缺 陷病 毒(Simi a n i m mu n o d e f i . c i e n c y v .S I V) ~种.Ts a i 等人曾发现, 抗HI V药物 AZ Td d C和ddA能影响 S R VI 感染的 R a j i 细胞的合胞体 的形成 , 病毒抗原的表达和逆转录酶 的水平【

4 ] .但未见利用 S R V 作为筛选 抗艾滋病药物模型的报道.我们在 HI V研究的专用 P 3实验 室建立之前, 为了建立一种安全 可靠、 可以快速筛选抗艾滋病药物的实验模型, 甩SRV作为体外筛选模型, 将合胞体 形成抑制 试验和药物对细胞的毒性作为药物筛选模型中的观察指标. 对该模型筛选 抗艾滋病药物的可 行性 进 行了 研究. 并 筛选 了几 十种天 然化 合物 . 取得了很 好 的效 果. 材料 与方法 I 药物

3 一叠氮胸腺 嘧啶 脱 氧核 苷(AZT,3一A z i d o 一3 一d e o x y t h y r a i d ] n e ) 购自Sigma公 司. 结 晶天 花粉 蛋白(Trichosamh i n , T C S ) 为中国科学院上梅 有机化学研究所金善炜教授提供 , S OS ―P A GE为电泳纯 . 溶 解于生理 收精 日期 :

1 9

9 6―0

4 ―0

8 . 修回 日期 :

1 9

9 6―0 8―2

3 - 中国科学院 八五 重大应用项 目( KY

8 5 ―0

5 ) 和云南省应用基础 研究基金资助项 目(

9 6 C o

9 5 M) 赫,一~一珧.维普资讯 http://www.cqvip.com 中国病毒学第l2卷 盐水 ,

0 .

2 2呷 滤膜除菌 , 测定蛋 白质浓度后分装. 置一20℃保存.其它待筛 选天然化台物分 别 由中国科学院 昆明植 物研 究所 J: 海有机化学研究所、 上海药 物研究所等提 供.

2 细胞 R 对i 细胞 为P.Marx博士 ( C a l i f o r n i a P r i ma t e R e s e a r c h C e n t e r ,Un i v e r s i t y o f C a l i f o r ni a ,U S A) 惠赠 .培养基为RP MI 一1

6 4

0 ( G i b e o ) . 含有 l

0 %小牛血清, 2mf n

0 I / L谷 氨酰胺 ,

1 0m n m l / LHE P E S ( S i g ma ) .

5 0mm o l / L

2 一ME ( B i

0 一R a d ) , l ∞ mL的青、 链霉 索3病毒的制备 S R V1由P.Ma r x博士 惠赠 .收集SRVI 感染 R a i i 细胞 后第7~8天 的培 养上 清.用Mi n i t a n超滤系统 ( Mi l l i p o r e ) 浓缩 l O倍.截 留分子 量为 加万I【E滴定感 染性扁毒 , 置 液氟保存 .

4 细胞毒性 试验 取5x10'

,mLRa j i 细胞 悬灌

1 0

0 L加至96孔细 胞培 养板 ( c ∞t ) 中,与不同谁 度的药物溶藏棍 台, 每个 浓度设置 6十孔 , 置37℃,

5 % o 培 养箱 中培养 . 第三天补充新鲜完 垒培 养基. 第 6天按 前述 方法测 定其细 胞毒性Ⅱ 】 .每孔 加5mg / mLMT T( sg 蝴)溶藏

2 0 L t

3 7℃

5 %

0 细胞培 养箱 中孵育

4 h , 每孔滴加

2 0

0 u L

2 0 % S D S一5

0 % DMF ,

3 7℃孵育

4 h , 用Bio―R a d

3 5

5 0E L [ S A仪测 定OD值(

5 9

5 /

6 5

5 n m) .I C S 0是对

5 0 % 的i细胞产生毒性时 的药物浓 度.

5 台_目体形成 抑棚试验 在96孔平 底细胞培 养板上, 将药 物用完 全培养基进 行 5倍 倍 比稀释, 共l0十 稀释度 , 每孔

1 0

0 t t L , 设6十重复孔 , 同时 设置正常细啦对 照. S R V| 感染细胞对 照.每孔 含l*l 个R舒细胞, 加 入谁缩 S R V| 上请, 感染复数( MOI ) 为1:13.置培 养箱内培养 , 第 3天补加新鲜 完全 培养基

1 0

0 . 第 6天后 观察药 物对 台胞 体形 成的影 响.在100倍的倒置显镦镜 下, 选取 5个不重 叠的视野 , 计敷 S R VI 病 毒诱导 R a i i 细胞形 成台胞 体数 .E C S 0为抑制台胞体 形 成达

5 0 %时 的药 物浓 度.选择 指教 ( S e l e c t i v i t yI n d e x ,S

1 ) 为IC50/EC50的 比值.结果和讨论

1 S R V体外筛选药物实验模型的建立 为 了鉴 别SRV 1感染Raii细胞形 成的 合胞 体, 测定 了正常 细胞 和合胞体 细胞 的 平均 直径 . 合胞体细胞的平均直径是正常细胞的

6 倍.合胞体形成的数量与 S R V

1 感染剂量有一定 的量 效关系. 我们模索了筛选药物的最适 MOI 值.为了验证此模型的可行性, 用AZT进行 了比较 实验.A Z T是一种类核苷酸类抑制逆转 录酶的药物, 是 目前被美国 F D A批准的少数几种可 用于l l 缶 床的抗 HI V药物. 结果表 明AZT抗 S R V的选择 指数 与国外其它实验 室利 用体 外抗 HI V药物的筛选模型所得出的选择指数基本吻合 ( 见表

1 ;

图1).2天花粉蛋 白对 S R V1的体外抑制作用 天花 粉蛋白(TC S ) 是从中药葫芦科植物栝搂[TrichosⅡtheskiritozviiMa x i m ( C u c Ⅲ一bltaeeae)]的球 根 中提 取的 一种 由247个 氨 基酸 组成的单 链核糖体失活蛋白(Ri b o s o me i n a c t i ― r a t i n g p r o t e i n ,RI P ) .T C S在体内外有抑制 HI V繁殖的作 用, 有些 方面优于 AZ T.T C S 不仅能抑制 C D 4+T细胞 内HI V一1的繁殖 , 而且对抑制单核 一巨噬细胞 内HI V―l的复制 特别有效 ….我 们以此实验模型检 删了 TC S对SRV1体外增殖 的影响.从图2可见, T C S 显著地抑制 S R V1 的繁殖, 抑制

5 0 %合胞体形成的药物剂量为

1 .

6 *1

0 ~ mL , 而TCS对 R a j i 细胞的

5 0 %毒性剂量为

1 .

5 5 mL, S I 值高达

8 ,

8 1

2 . 维普资讯 http://www.cqvip.com 第1期郑永唐等 : 用猴艾激病 D墅逆转录病毒 筛选 抗艾滋病 药物宴验模型 的建立及应 用63衰1AZT体外抗 HI V和SRV的比较 T~ b ] e1 Th e c o mp a r is o n

0 f a n

1 i ― HI V

0 T c H~t a o fAZT i n m ・ F r o m Na t u r e

1 9

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3 4

3 :

4 7 0~4

7 4 . S I =1 C

5 0 / E C

5 0

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0 1 O O

8 o 苗86O4020O--3... ― 口// _ / 圈log¨o f AZ T e c n ~'

n t r a t l o u ( p g / mL ) 图lAZT体 外抗 S RVI 的作用 Fi g I ~ i t r o a 力 一SRV I a c t i v i t y AZT

3 抗艾滋病天然药物的筛选 从我国传统药物和天然资源中寻找新药物或先导化台物受到各国科研工作者的重视.除 天花粉外, 发现有抗 HI V作用的还有 TA P

2 9 . 甘草甜索, 喜树碱, 丝瓜蛋 白, 姜黄 索, 苦瓜子蛋 白, 金丝 桃 素等 .与 有关 单位 合作,用建 立 的模 型对 数十 种来 源 于天 然资 源的化台物 进行了筛 选.结果见表

2 .其中的

2 6种RI P s 类化台物有 l 7种(

6 s

4 %) 具有抑制 S RVI的作用.现正 对初筛有效的化台物作进一步的抗 H1 V的研究. 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国病毒学第l2卷 B

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0 . g5 I o g ¨ T C S∞ Ⅱ . e n na 矗on(,皿L ) 图2王花糖蛋白体补抗 S R V! 的作用 F

2 / n 优f a n t i S RVI a ni 【 y Tcs 衰246种天然化台轴 的抗 S RV的活性 T~ h l e

2 An t i ― S RV a c z i v i t y o f

4 6 T l a t u 姐l c omp o u n ~ 参考文献I张兴传. 投可久 . 唐 小山等 .几种 药物抑制马传染性贫血病毒和 ^免疫映陷病毒 的实验 研究 . 病毒学报 .

1 9

9 2 ,

8 :

3 8 ~4

3 2 王岱. 驮运 琪, 徐为^等.用牛免疫雠 陷病毒精选抗艾滋病药物实验檀型 中国药理学 与毒理学杂志.

1 9

9 6 .

1 0 :

4 9 - -5

2 3 陈志斌, 贲昆龙 . 猴 芟滋病与 D型逆转 录病毒 动物学研究.

1 9

9 2 .

1 3 :

1 9

3 ~1

9 9 .

4 Ts a l C C,Fo [

1 i sKE.Be u ~ t e RE An t l v l r a l bo f

3 一a z 一3 一d e o x y t h y r md e ,2 .

3 一d i d e o x y e y t l d i n e . a n d

2 .

3 出d e y a d … a g a i ns t s i mi a n a c r i m mu r e i 朋synd r o me一~.~u c i a t e d t y p e D ~t r o v i r u s i n 优f AI DS R H u m Re t mv i ~ s e s ,

1 9

88 . 4:

3 5 9~

3 66

5 郑永唐 . 贲 昆龙 . 检 则细胞存活和增殖 的MT T方法 的建立 免疫学杂 志.

1 9

9 2 .

8 :

2 6

6 ~2

6 9

6 Pa u wdl s R,An dr i ~ K.De s my t e r J d Po t e n t a n d s e l e c b v ei n h i b i t i o n o fHI VI~p l i c a t i nni ~ / t r o h v an吖e I s 盯j

0 f TI BO d e r n― Na t ~e . J

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3 4 3:

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4 7 C o l l i n s EJ .Ro b e r t u s .J D.L o p r e s t iM ￡ a t Pr i ma r y… a 口d卿帅0fa―t r i c h o s a n t h l n a n dmde c u l a rmo d e l sf

0 f a b r J n A―e h a i n a n d a ―t r i c h o s a n t b i n J B 瑚chem.1

9 9

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9 8 任猷 主编 . 天花粉蛋 白 北京 : 科学出版社,

1 9

9 0 : I ~1

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9 Mc Gr a t h B S,Hwa n g KM , Ca ] d wdl S E a

1 .GLQ2

2 3:An i n h i b i t o r0 f hu ma n… Ⅷ

0 d t f kj i r u s r e p l i c mi nn i … e l a c h r o n i c a l l yi nf ~t e d c e l l s ofl y mph o c y t e [ i n ~ g e № Na t /A∞d S c iUS A. I

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2 8

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1 0 Ka h n J O.Go r e l i c k脚.Ga t t i G a

1 .S a f my .a c t i v i t y. a n d p h a r m…o ki n t … f GLQ2

2 3 i n p a t i ~ wi t h AI DS d AI DS― r e l a t e d ~ p l e x An t i mi c r o b A t s Ch e mo t h e r . J

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2 6

7 维普资讯 http://www.cqvip.com 第1期郑永唐等 : 用猴艾滋痛 D型逆转录病 毒筛选抗 艾滋 病药物实验模 型的建立及应用

6 5 Es t a bl i s h m e n t a n d Ap pl i c a t i o n o f a n Ex pe r i me nt a l M o d e l f o r S c r e e ni n g Ant i ― ― AI DS Dr u g s wi t h S i m i a n Ty pe D Re t r o v i r u s Z h e n g Yo n g t a n g B e n Ku n l o n g W a n g J i n g h u a n Qi J i n Hu a n g S h e n g n ~ n g ( Ku n mi n gI n s t i t u t e矿2.珈,T l wC h i n e s e A c a d e myo fS c i e n c e s .Ku n mi n g

6 5

0 2

2 3 ) B e c a u s e o f t h e c l o s e p h y l n g e n e t i c r e l a t i o n s h i p , t h e s i mi a n a c q u i r e d i mm u n o d e f i c i e n c y s y n ― d r o me( S AI DS )i s c o n si d e r e d a s a n

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