PDF《腺相关病毒》

腺相关病毒 ―― 在动物实验中的主要应用 腺相关病毒在动物实验研究中的问题 注射多少病毒? 注射的部位? 什么时间检验? 腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),作为一种将外源基因转入动物组织 和细胞的病毒载体已越来越多地为生物科学研究人员应用于广泛地动物体内研究中 .

虽然很多实验室都建立了独特的腺相关病毒动物体内注射方法,很多刚刚接触腺 相关病毒的研究人员仍不是很清楚如何注射,应当注射多少病毒,注射的部位如何 选择,注射动物,特别是小鼠的发育时间的选择,在注射后什么时间去检测等等. 由于研究领域的不同,研究的动物不同,腺相关病毒的动物注射很难有较简单并且 可以广泛使用的方法.我们试图通过几种常见的方法为大家提供一个基本概念.具 体科研实验还需每个研究人员具体摸索. 腺相关病毒的生产,纯化和保存 1.粗病毒中带有大量的细胞蛋白和DNA,这些杂 质在进入动物体内时会造成动物较强的免疫反应 ,这样的病毒得到的结果是不可信的. 2.在病毒生产过程中会产生大量的不带有病毒基 因组的所谓空病毒,这些病毒进入动物后会竞争 ,阻断有效病毒与细胞的结合,从而降低病毒的 侵染效果. 3.粗病毒中的有效病毒滴度低,且易于细胞污染 蛋白结合,所以达不到注射后需要看到有效反应 的病毒量. 腺相关病毒一般是利用表达质粒 在HEK293细胞中表达病毒蛋白 和带有外源基因的病毒基因组, 并在细胞内组装而产生的.在HEK293细胞中产生的粗病毒是 不可以用于动物体内注射的.其 原因有这样几点: 腺相关病毒的生产,纯化和保存 目前常用的腺相关病毒纯化方式有氯化铯密度梯度离心,肝素亲和 柱,离子交换柱,和最新的碘克沙醇梯度离心等.纯化后的病毒需 进一步透析去除离心介质,并浓缩到较小的体积和较高的滴度.通 常纯化浓缩后病毒滴度达到10^12CG/Ml时就可以用于大多数动物体 内注射研究了. 腺相关病毒物理稳定性很好,病毒经分装后在磷酸盐缓冲液中,放 置在-80度可以长期保存.几年内病毒不会有感染活性和滴度的明 显下降. 目前腺相关病毒主要用于的研究

01 对某些细胞的特异性荧光标记

02 对神经系统某些投射路径的标记

03 基因过表达或基因表达抑制

04 在Cre转基因小鼠中,对于特定细胞的标记, 基因过表达或基因表达的抑制

(一) 对某些细胞特异性的荧光标记 Fluorescent labeling of cell populations 我们结合Ji-yoen Kim 发表的结果先介绍下AAV病毒用于荧光蛋白基 因的初生小鼠的大脑注射以帮助了解如何利用AAV来在动物体内做细 胞标记. 通过标记动物体内是少数细胞并改变他们的基因信息,从而能在野 生型的背景上研究把动物体内这些变异细胞的功能,这一方法称为 镶嵌动物模型(mosaic animal models).比如,通过在小鼠体内 嵌合表达荧光蛋白,就是研究体内神经细胞的形态的有力工具.

(一) 对某些细胞特异性的荧光标记 Fluorescent labeling of cell populations 近期,一种向新生小鼠脑室中注射重组 AAV的方法表现出前所未有的优势.这种方 法不仅操作简单,而且能够产生迅速而持 久的荧光标记.最重要的是,可对整个大 脑中的神经元实现广泛的转导,并对大脑 中的细胞群体进行特异性标记.此法最初 由John Wolfe提出,并由Ji-Yoen Kim等人 完善.我们在此就根据他们发表的论文对 这一技术进行一些简介,主要内容和结果 均来自他们发表的(论文引用). 1.简单、安全的AAV侧脑室注射法 进行重组AAV注射时,精确靶向侧脑室可使得脑损伤降到最小.选取出生后6小时 的P0小鼠,精确定位两个侧脑室注射点――一个插入点是位于λ与眼睛之间的假想 线的2 / 5处(近λ);

另一个点是位于λ和前囱点连线的中点,距离矢状缝1mm处(Fig 1A &

1B).将注射针垂直插入头骨表面深3mm处,把总体积为2μL的重组AAV、 PBS和0.05%的台盼蓝染液推入. Table1 1.简单、安全的AAV侧脑室注射法 准确注射后,应观察到从嗅球到小脑之间连贯整个大脑脑室的染色.在喙纹状体部 位的大脑横切面应显示染料填充整个脑室且限制在脑室内(Fig 1D).值得注意的是, 选择合适大小的针头既能够避免组织损伤,又能防止针头堵塞.利用此AAV侧脑室注 射法可得到大于95%的小鼠生存率和较为一致的感染模型,且不会出现组织损伤. Figure 1. Intracranial injection of adeno-associated virus into the cerebral lateral ventricles of neonatal mice. 2.重组AAV侧脑室注射拥有出色的荧光标记效果 将eYFP或tdTomato重组到AAV8中注射到P0小鼠 侧脑室,3至4周后观察到新生小鼠大脑被AAV广泛 感染.其中,嗅球、纹状体、大脑皮质、海马区 和小脑出现密集的荧光标记(Fig2A-H).同时, 上下丘、延桥、脑髓中也存在荧光标记,并且从 脑髓液中扩散到第四脑室及蛛网膜下腔(Fig 2G &

2H).而成年小鼠侧脑室注射只引起注射部位 周围的有限感染(Fig 2I,J vs 2K,L).不仅如 此,P0小鼠行AAV侧脑室注射12个月后,荧光分布 依然同注射后3周时保持在相同组织结构中,并维 持相似的荧光强度. Figure 2. Neonatal intraventricular AAV injection produces widespread and long-lasting transgene expression in the brain. 2.重组AAV侧脑室注射拥有出色的荧光标记效果 重要的是,新生小鼠注射后未出现发育畸形. P0注射AAV的小鼠的大脑区域都呈现正常的形态和 神经解剖学结果,甚至通过免疫组化染色星形胶 质细胞和小神经胶质细胞,发现形态与未注射的 野生型一致.同时,也没有小鼠表现出明显的行 为异常.AAV注射后基因表达出现的时间是很快的. 在P0注射EF1-α启动编码tdToma基因,两天后就 可以检测到tdTomat在大脑中的广泛表达,表达强 度在一周内持续增加,到了出生后第7天可达到注 射后6-12个月的荧光强度.AAV侧脑室注射后的基 因表达呈现出意想不到的速度,这也给研究新生 小鼠早期脑发育提供了功能强大的新工具. Figure 2. Neonatal intraventricular AAV injection produces widespread and long-lasting transgene expression in the brain. 3.重组AAV侧脑室注射具有灵活的可调控性 重组AAV侧脑室注射这一方法还具有更个性化的选择可能. 不同的AAV血清型、启动子、注射时间 以及病毒滴度皆可产生不同的组织嗜性、 细胞特异性和感染效率, 遂可根据实际研究目的来选择合适的实验条件. 3.1 重组AAV的血清型和启动子 可调节病毒基因表达的区域 通过比较AAV

1、AAV6和AAV8发现,血清型不同的 AAV在侧脑室注射以后会对特定神经元和细胞类型 产生偏好性(Table 2).总体来说,AAV1和AAV6更 倾向于感染无须进入软组织就可到达的脑室室管 膜细胞层.其中,AAV1在新皮层的浅层区域、嗅 球和尾大脑皮层呈现密集表达.然而,相比AAV1 和AAV8来说,注射AAV6后荧光表达较为稀疏,主 要集中在腹侧小脑小叶VIII、 IX和X(Fig 4). 基因的表达速度并没有因AAV血清型的改变而发生 变化,与注射重组AAV8相同,注射重组AAV1和重 组AAV6都在P2时即呈现明显荧光标记 . Table

2 3.1 重组AAV的血清型和启动子 可调节病毒基因表达的区域 当在重组AAV8中使用不同的启动子时发现,使用CBA(Chick βactin)启动子的 AAV8-CBA和使用EF1α(Elongation factor

1 α)启动子的AAV8-EF1α在整体转导区 域上基本一致.值得注意的是,与AAV8-CBA相比,AAV8-EF1α基因表达更快达到饱和, 且更倾向于转导小脑浦肯野细胞;

而AAV8-CBA在新皮层中的表达更均匀一致(Table 3). Table

3 3.1 重组AAV的血清型和启动子 可调节病毒基因表达的区域 尽管不同血清型的重组AAV和不同 类型的启动子能够影响病毒基因表 达的区域,但通过NeuN标记神经元 发现,它们的共同点是特异标记大 脑中的神经细胞. Figure 4. Both serotype and promoter influence the onset and pattern of transgene expression. 3.2 重组AAV注射时间 可调控病毒感染的效率及细胞类型 分别在P

0、P

1、P2或P3将滴度为2.0*109VP的AAV8注射 到同窝出生的小鼠侧脑室中,4周之后观察转基因情况. 发现P1与P0注射没有明显差别,而P2或P3的AAV延迟注射 导致大脑结构远侧部位病毒表达减少,如大脑皮层浅层 区域、嗅球、小脑等(Fig 5A、C、E).不仅如此,通过Iba1和S100β标记小胶质细胞和星形胶质细胞发现, 延迟注射时间还使得在除了嗅球以外的大部分区域出现 大量被标记的非神经细胞(Fig 5B、D、F),且主要是 星形胶质细胞.脑室内注射AAV8的时间能够显著影响整 体转导水平,同时提供了一种特异标记星形胶质细胞的 新方法(Fig

5 G-L). Figure 5. Timing of AAV8 injection alters the pattern and cell-specificity of transduction. 3.3重组AAV滴度可调控转基因嵌合程度 使用病毒介导转基因的优势之一就是可以通过调整病毒滴度来改变转导效率. 把AAV8-YFP和AAV1-YFP稀释至1010VP/μL到108VP/μL,将2μL病毒分别注射 至P0小鼠侧脑室.整体上看,可发现大脑中荧光标记的强度随病毒滴度的降低 呈现明显减弱,AAV1荧光减弱程度更(Fig 6A). 3.3重组AAV滴度可调控转基因嵌合程度 其中,AAV8滴度的降低并不影响荧光分布的区域,仍旧对整个大脑的神 经元进行转导;

而AAV1滴度的降低使得病毒对脉络丛呈现极高的亲和性 (Fig 6B). 3.3重组AAV滴度可调控转基因嵌合程度 通过优化病毒滴度,可以构建两种研究模型.一种是通过注射高滴度的AAV, 构建许多转基因神经元包围个别野生型神经元的模型,进而可以进行病毒转 导对细胞外影响的相关研究;

另一种是通过注射较低滴度的AAV,构建个别转 基因神经元模型,进行病毒转导对细胞内影响的相关研究(Fig 6C). 3.3重组AAV滴度可调控转基因嵌合程度 如Ji-Yoen Kim,John Wolfe等人的工作所显示的,在小鼠出生后不久,利用AAV侧脑室注射表达的荧光蛋白的方法具有可以标记各种神经细胞和神经 胶质细胞.对于AAV血清型, 启动子,注射时间,和注射量的控制,就可 以根据实验的需要标记不同的细胞,不同数目的细胞.既可以在野生型的 背景上研究少数带有外源基因的细胞,且可以在改变了基因的背景上研究 野生型的细胞.由于AAV的高侵染性,表达出现迅速,且表达时间长,这个 方法的建立,可以极大地推动从动物神经细胞,组织发育,神经网络的建 立,到神经细胞功能联络等多方面的研究. 维真生物在国内建立起了多方面的AAV病毒的克隆,包装和纯化服务 .我们提供目前常见的AAV的所有血清型的病毒包装和纯化.并提供数十 种不同的组织和血清特异性的启动子.我们包装和纯化的AAV9型的神经 细胞特异启动子的GFPAAV病毒在用类似的方法注射到小鼠神经系统后可 以特异地标记多种神经细胞,包括大脑皮层,海马区的神经细胞和脊椎 腹角及背角的运动和感觉神经元细胞. 维真生物的AAV克隆、包装、纯化 ........