PDF《马齿苋总黄酮的超声波辅助提取工艺优化 及其抗氧化、》

中国农学通报

2019 Chinese Agricultural Science Bulletin 马齿苋总黄酮的超声波辅助提取工艺优化 及其抗氧化、 抗肿瘤活性研究 梁艳妮, 唐志书, 张晓群, 李莎, 赵梦薇, 王征(陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心/陕西省中药基础与新药研究重点实验室, 陕西咸阳 712083) 摘要: 优化马齿苋中总黄酮的甲醇浸提-超声波辅助提取最佳工艺, 并评价其体外抗氧化、 抗肿瘤活 性.

以甲醇浓度、 提取温度、 料液比和超声功率为因素, 以总黄酮提取率为指标, 通过单因素试验与正交 设计优选马齿苋总黄酮的超声波辅助提取条件;

测定其对DPPH ・ 和・OH的清除能力评价抗氧化活性;

MTT法测定其对人肺癌细胞A549体外增殖的影响.结果表明: 马齿苋总黄酮的最佳提取工艺为: 料液 比1:50, 温度 80℃, 超声功率

200 W, 甲醇浓度 90%, 提取

30 min, 提取

2 次, 总黄酮提取率为 6.37%.马 齿苋总黄酮对DPPH ・ 清除率在4.0 mg/mL为89.80%, 对・OH清除率在20.0 mg/mL为86.07%;

其质量浓 度为420 μg/mL时对细胞A549增殖的抑制率为74.62%, 与阳性药组无显著性差异.该优化工艺准确可 靠, 提取率高;

马齿苋总黄酮具有较强的抗氧化和抗肿瘤活性. 关键词: 马齿苋;

总黄酮;

正交设计;

DPPH ・;

・ OH;

A549 中图分类号: R284.2, R285.5 文献标志码: A 论文编号: casb18090056 Optimization of Extracting Total Flavonoids from Portulaca oleracea L. by Ultrasonic Method and Evaluation of Their Antioxidant and Antitumor Activities in Vitro Liang Yanni, Tang Zhishu, Zhang Xiaoqun, Li Sha, Zhao Mengwei, Wang Zheng (Shaanxi University of Chinese Medicine/Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization/ Shaanxi Province Key Laboratory of New Drugs and Chinese Medicine Foundation Research, Xianyang Shaanxi 712083) Abstract: To explore the optimum extraction process of flavonoids from Portulaca oleracea L. by methanol leaching-ultrasonic assistance and evaluate its antioxidant and anti-cancer activities. Based on single factor experiment, methanol concentration, extraction temperature, solid- liquid ratio and ultrasonic power were enrolled in this experiment, and the extracting ratio of total flavonoids was used to evaluate the extraction process. The extraction process of total flavonoids from P. oleracea L. was optimized by orthogonal experiment. Meanwhile, the antioxidant activity of flavonoids was assessed by scavenging assays of DPPH・ and ・OH. The viability of human lung cell line A549 was detected by MTT assay. The optimal extraction process was as follows: liquid-solid ratio of 1:50, water bath temperature of 80℃, ultrasonic power of

200 W, 90% methanol as extraction solvent, extraction time of

30 min, extraction of

2 times. The extraction rate of total flavonoids from P. oleracea L. was 6.37% under the optimal condition. The scavenging rate of DPPH ・ was 89.80% at 4.0 mg/mL, while the scavenging rate of ・ OH was 86.07% at

20 mg/mL. The inhibition rate of cell A549 proliferation was 74.62% at

420 μg/mL, which had no significant difference from that of the positive drug group. The flavonoids from P. oleracea L. are extracted efficiently by the above optimized technology and the 基金项目: 陕西省科技厅重点产业创新链 (群) 项目 基于活性导向策略的寒性中药中抗肿瘤活性成分发现与评价研究 (2018ZDCXL-SF-01-02-02);

陕西省科技厅项目 色胺酮治疗溃疡性结肠炎作用机制研究 (2018SF-193). 第一作者简介: 梁艳妮, 女, 1986年出生, 陕西渭南人, 讲师, 博士, 研究方向: 中药抗炎免疫.通信地址:

712083 陕西省咸阳市秦都区渭阳中路1号陕西中医药大学北校区, Tel: 029-38035207, E-mail: [email protected]. 通讯作者: 王征, 男, 1986年出生, 陕西礼泉人, 副教授, 博士, 研究方向: 中药活性物质基础的发现与活性评价.通信地址:

712083 陕西省咸阳市秦都 区渭阳中路1号 陕西中医药大学北校区, Tel: 029-38182201, E-mail: [email protected]. 收稿日期: 2018-09-12, 修回日期: 2018-11-20. 中国农学通报 2019,35(4):130-135 Chinese Agricultural Science Bulletin total flavonoids exhibit antioxidant and antitumor activities. Keywords: Portulaca oleracea L.;

total flavonoids;

orthogonal design;

DPPH・;

・OH;

A549

0 引言 马齿苋为马齿苋科植物马齿苋(Portulaca oleracea L.)的干燥地上部分, 为草本药食同源植物, 具有清热 解毒、 凉血止血、 止痢作用[1] .临床常用于热毒血痢, 痈肿疔疮, 丹毒, 蛇虫咬伤, 湿疹, 便血, 痔血, 崩漏下 血等[2] .国内外学者对其化学成分、 药理活性[3-4] 进行 研究, 马齿苋主要含有黄酮类、 萜类、 香豆素类、 有机酸 类、 挥发油及多糖等化学成分.马齿苋全草中总黄酮 可达 7.67%[5] , 其中包含槲皮素、 芹菜素、 山奈酚、 杨梅 素、 木犀草素、 橙皮苷等, 具有降血脂[6] 、 抗菌[7] 、 抗氧化[8-9] 、 抗肿瘤[10-11] 等多种生理活性, 另马齿苋乙醇提取物还具有 止咳[12] 、 保护细胞[13] 、 保肝作用[14] .已有采用加热回流[8,15] 、 超声辅助[16-17] 、 微波辅助[16,18] 、 超临界CO2 提取[19] 等提取 马齿苋总黄酮的优化工艺报道, 提取溶剂多为 70%~ 75%左右的乙醇, 采用新技术虽然有利于提高提取率 但结果差异较大, 总黄酮提取率在 0.64%~7.67%不等.超声波辅助提取法具有提取时间短、 效率高、 成本 低以及降低温度对提取物影响的优点.本试验拟通过 单因素试验与正交设计优化马齿苋总黄酮的超声波辅 助甲醇提取工艺.有关马齿苋不同提取部位抗氧化活 性已有多篇报道, 表明马齿苋黄酮提取物对 DPPH・ 的清除率可达到 90.73%[17] , 对・OH 的清除率可达 73.12%[15] , 对O2 - 的清除率为 49.02%[15] , 但多数抗氧化 活性检测采用原料为马齿苋总黄酮粗品, 并未经过纯 化处理, 其试验结果需进一步验证.马齿苋提取物对 抗癌作用研究较少, 对肺癌细胞增殖的影响仅有

2 篇 报道[11,20] .崔丽敏等[11] 研究表明, 马齿苋80%乙醇提取 物可诱导肺癌 A549 细胞凋亡, 改变细胞周期分布, 抑 制细胞增殖;

李玉萍等[20] 认为, 马齿苋总黄酮对细胞 A549 无明显抑制作用.本试验将考察经大孔树脂 HPD600纯化过的马齿苋总黄酮对DPPH ・ 和・OH的清 除率, 对肺癌细胞 A549 增殖的抑制作用, 以期为马齿 苋总黄酮的生物活性研究提供依据.

1 材料与仪器 1.1 细胞株 人肺癌细胞A549, 由第四军医大学提供. 1.2 药品与试剂 马齿苋 (批号 20171101, 陕西兴盛德药业有限责 任公司) 为马齿苋科植物马齿苋(Portulaca oleracea L.) 的干燥地上部分, 由陕西中医药大学王继涛高级实验 师鉴定.芦丁对照品 (批号 wkq16031602, HPLC≥ 98%) , 购自四川省维克奇生物科技有限公司;

胎牛血 清 (杭州四季青生物工程材料公司) , RPMI-1640 培养 基(HyClone);

双抗(HyClone);

DMSO (天津科密欧化学 试剂公司) ;

MTT (Sigma);

PBS (HyClone);

所用试剂均 为分析纯, 水为纯净水. 1.3 试验仪器 UV-2600 型紫外分光光度计 (日本岛津公司) ;

KQ-300DE 型数控超声波清洗仪 (昆山市超声仪器有 限公司) ;

MultiskanTM GO 全波长酶标仪 (美国 Thermo Scientific) ;

311 型CO2 培养箱 (博西华家用电器有限 公司) ;

DSZ2000倒置光学显微镜 (北京长恒荣创科技 公司);

SW- CJ- 2FD 超净工作台( 美国Thermo Scientific) ;

GB204 型电子天平 (瑞士梅特勒-托利多 公司) ;

FA2004B 型1/10000 电子天平 (上海佑科仪器 仪表有限公司);

VaCo5 低温冷冻干燥仪(Zibrus Technology);

HH-2 型恒温水浴锅 (北京科伟永兴仪器 有限公司) ;

FE-1000AD固体粉碎机 (天津鑫博得仪器 有限公司) .

2 结果与分析 2.1 标准曲线的制作 以芦丁为对照品采用亚硝酸钠-硝酸铝法绘制标 准曲线.即精密称取芦丁对照品适量, 60%乙醇溶解 配制 267.2 μg/mL 的芦丁对照品溶液.精密量取 0.

8、 1.

2、 1.

6、 2.

0、 2.

4、 2.8 mL的对照品溶液于分别置于10 mL 容量瓶中, 以空白为对照, 各加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL, 振摇, 静置

6 min;

各加 10%硝酸铝溶液 0.3 mL, 振摇, 静置

6 min;

各加 4%氢氧化钠溶液

4 mL, 60%乙醇定 容, 摇匀, 静置15 min, 在波长510 nm测定吸光度.以 芦丁浓度为横坐标, 吸光度为纵坐标, 绘制标准曲线得 线性回归方程y=0.009x+0.0194(r=0.9989), 线性范围为 21.4~74.8 μg/mL. 2.2 供试品的总黄酮测定 将马齿苋药材粉碎, 石油醚回流脱脂后, 回收石油 醚.精确称取干燥马齿苋粉末2 g, 在考察提取因素条 件下 (料液比、 浸提温度、 超声波功率和甲醇浓度) 加入 一定体积分数的甲醇溶液, 浸泡

30 min 后, 在一定温 度和超声功率下提取

30 min, 放冷后过滤, 离心, 合并 2次提取液, 旋转蒸发浓缩至粘稠状浓缩液, 60%乙醇 定容至10 mL容量瓶, 为待测液.精密量取1 mL待测 液于

10 mL 容量瓶中, 按照 2.1 项下方法测定吸光度, 根据芦丁标准曲线计算总黄酮提取率. 梁艳妮等: 马齿苋总黄酮的超声波辅助提取工艺优化及其抗氧化、 抗肿瘤活性研究 ・ ・

131 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 2.3 单因素试验 2.3.1 浸提浓度对马齿苋总黄酮提取率的影响 精确称 取干燥马齿苋粉末2 g于圆底烧瓶中, 以料液比1:30, 浸提 温度为70℃, 超声功率为300 W, 浸提时间30 min, 提取2 次的条件下考察不同甲醇体积分数(50%、 60%、 70%、 80%、 90%)马齿苋中总黄酮的提取率, 见图1.从图1可 以看出, 马齿苋中黄酮的提取率随甲醇体积分数的增大 先增后减, 当甲醇浓度在80%时黄酮提取率最高. 2.3.2 料液比对马齿苋总黄酮提取率的影响 精确称取 干燥马齿苋粉末2 g于圆底烧瓶中, 以甲醇浓度80%, 浸提温度 70℃, 超声功率为

300 W, 浸提时间

30 min, 提取2次的条件下考察不同料液比(1:

20、 1:

30、 1:

40、 1:

50、 1:60)马齿苋中总黄酮的提取率, 见图2.从图2可以看 出, 马齿苋中黄酮的提取率随料液比增大先增后减, 当 料液比1:40时黄酮提取率最高. 2.3.3 浸提温度对马齿苋总黄酮提取率的影响 精确称 取干燥马齿苋粉末

2 g 于圆底烧瓶中,以甲醇浓度80% , 料液比1:30, 超声功率为300 W, 浸提时间30 min, 提取

2 次的条件下考察不同浸提温度下 (

40、

50、

60、

70、 80℃)马齿苋中总黄酮的提取率, 见图3. 从图

3 可以看出, 马齿苋中黄酮的提取率随温度升高 先增后减, 浸提温度70℃黄酮提取率最高. 2.3.4 超声功率对马齿苋总黄酮提取率的影响 精确称 取干燥马齿苋粉末

2 g 于圆底烧瓶中, 以甲醇浓度 80%, 料液比1:30, 浸提温度70℃, 浸提时间30 min, 提取 2次的条件下考察不同功率(

100、

200、

300、

400、

500 W) 马齿苋中总黄酮的提取率, 见图 4.从图

4 可以看出, 马齿苋中黄酮的提取率随超声功率增大先增后减, 超 声功率为300 W时黄酮提取率最高. 2.4 正交试验设计 在单因素试验的基础上优化甲醇超声波辅助提取 马齿苋总黄酮的工艺参数, 提取2次, 浸提时间30 min, 以总黄酮提取率为考察指标, 选择甲醇体积分数、 料液 比、 浸提温度、 超声功率为考察因素, 采用4因素3水平 设计正交试验.因素水平见表 1, 正交试验结果见表 2, 方差分析见表3. 图1 浸提浓度对总黄酮提取率的........