PPT《第十一章》

第十一章 抗生素类药物的分析

第一节 概述 抗生素的定义 抗生素是细菌、放线菌和真菌等微生物的代谢产物,对各种病原微生物有强大的抑制或杀灭作用.

一 抗生素药物的特点生物发酵, 化学纯化,精致,化学修饰等过程,最后制成制剂,结构,组成更复杂. 化学纯度低,有三多:同系物多,异构体多,降解物多.发酵过程不易控制.生产工艺复杂易受污染.分子结构大多不稳定,降解后疗效下降、失效或增加毒副作用.活性产物易发生变异. 发酵液中杂质 无机盐、脂肪、各种蛋白质、各种降解产物、色素、热原、毒性物质 [检查] 增加异常毒性、细菌内毒素、热原、降压物质、无菌 二 质量分析的测定方法

(一)生物学方法

1 测定抗生素抑菌或杀菌的能力 优点

1、与临床效果一致

2、灵敏度高

3、干扰物质少 缺点

1、操作繁琐

2、培养时间长

2、测定误差大 2化学及物理化学方法 以理化方法测定主药含量 优点 1. 准确度高2. 简单、快速 1. 不一定代表生物效价 缺点 2. 易受杂质干扰 三 分类(按结构与性质): βC内酰胺类、氨基糖苷类、 四环素类、大环内酯类、 氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类 林可霉素类、其他抗生素类

第二节 βC内酰胺类抗生素 青霉素类 头孢菌素类 青霉素 (青霉素G、苄青霉素) 氨苄西林(氨苄青霉素) 阿莫西林(羟氨苄青霉素) 普鲁卡因青霉素 头孢氨苄 头孢拉定 头孢羟氨苄 头孢噻吩钠 一 结构与性质

(一)羧基 酸性 Na 与碱金属(Na+、K+)成盐易溶于水 与有机碱(普鲁卡因)成盐难溶于水 普鲁卡因青霉素

(二)手性C 旋光性 (5%头孢唑啉钠溶液 C18~C24°) 青霉素类 C3 C5 C6头孢菌素类 C6 C7 ~ ~ ~ ~ ~

(三)共轭体系 UV青霉素类母核无明显UV,多数有苯环取代基头孢菌素类 母核有共轭体系 青霉素钠UV7-20

(四)βC内酰胺环 干燥纯净时 - 稳定水溶液: 不稳定 不稳定性因素 四元环张力大 酰胺键易水解 (某些金属离子)(温度) 某些氧化剂 例 青霉素的降解反应 青霉素 青霉噻唑酸 H2O/OHˉ 青霉素酶 青霉酸 H2O pH2 100℃ αC青霉噻唑酰基羟胺酸 NH2OH 青霉烯酸 pH4 青霉胺 CO2 青霉醛 HgCl2 二 鉴别

(一)呈色反应 1. 羟肟酸铁反应 β-内酰胺类 NaOH 呈色 Fe3+/3 H+ H+ Fe3+/3 (红、棕、褐) 2.类似肽键的反应 茚三酮反应 α-氨基 α-氨基、伯胺某些羟基胺类 酮式 烯醇式 茚三酮 茚三酮 缩合 蓝紫色 (开环分解) 似肽键 双缩脲反应 β-内酰胺类 蓝紫色 3其他显色反应 与变色酸-硫酸反应青霉素 阿莫西林 氨苄西林 活泼 -CH2- (分解) 变色酸 显色 150℃ (缩合) (缩合) 与重氮苯磺酸反应 头孢哌酮 (偶合) 酚羟基 (偶合) 与H2SO4 - HNO3反应 头孢菌素类

(二) K+、Na+反应 焰色→鲜黄色 + 醋酸氧铀锌→↓黄Na+ 焰色→紫色 + 0.1%四苯硼钠 + Ac→↓白K+ 与铜盐反应 橄榄绿色 NaOH 专属反应 沉淀反应 1. 遇酸→↓ 在过量HCl或有机溶剂中溶解 有机胺盐反应 (1)重氮化 - 偶合反应 重氮化-偶合反应 芳伯氨基 普鲁卡因 普鲁卡因青霉素 (2)与三硝基苯酚反应 二苄基乙二胺 mp 三硝基苯酚 光谱法

(三)

1、 IR法 阿莫西林的红外光谱图 β-内酰胺环 酰胺 青霉素

2、 UV法 样品、分解产物 Cu2+ 头孢氨苄 λmax = 262nm 青霉素V钠A280nm/A264nm = 1.30~1.50 取本品,加醋酸-醋酸钠缓冲溶液pH3.8,制成50ug/ml的溶液,取10ml,水浴加热,以未加热的共试品为空白.测定,吸收度0.6. Cu2+ pH3.8 氯唑青霉素

341 0.682 双氯青霉素

342 0.653 苯唑青霉素

339 1.328 (nm)

(四)色谱法 对照品对照法

1、 TLC法

2、 HPLC法 特殊杂质的检查

(一) 聚合物 中国药典规定,头包曲松,哌酮,噻肟需检查聚合物.用HPLC,以他啶为例. 对照溶液的制备 取对照品适量,精密称定,加水制成100ug/ml溶液,摇匀. 测定法 取对照品适量,精密称定,加水制成,20ug/ml进样.含聚合物不得超过头孢他定的0.3%.

(二)有关物质和异构体(P273) 头孢氨苄中有关物质的检查(反相TLC法)头孢氨苄以青霉素钾为原料,经氧化、扩环、裂解得7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA),再与侧链a-苯甘氨酸缩合而成.这两种原料有可能成为主要杂质.用茚三酮显色, a-苯甘氨酸和7-ADCA斑点显橙黄色.

(三)杂质吸收度的检查 青霉素钠(钾):取本品,加水,1.80mg/ml.280nm不得大于0.10,264nm应为0.80-0.88.264nm的吸收值用来控制青霉素钠(钾)的含量.280nm的吸收用来控制杂质.

四、 含量测定 碘量法

(一) β-内酰胺类 ChP 利用其分子本身不消耗碘,而降解产物消耗碘,用剩余碘量法测定,以标准对比法计算. (水解) 1.原理 水解产物 定量过量 剩余 反应分两步进行:1. 水解反应 (按化学计算量进行)2. 氧化-还原反应 (无固定的量关系,受温度、PH值和时间等因素影响,应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定) 第一步 第二步 例 注射用普鲁卡因青霉素 含量测定 取装量差异项(药典附录P7)下的内容物,精密称取约0.12g,置100ml量瓶中,加水使溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取5ml,置碘瓶中,加1mol/L氢氧化钠溶液1ml放置20分钟, 再加1mol/L盐酸溶液1ml与醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5)5ml,精密加入碘滴定液(0.01mol/L)15ml,密塞,摇匀,在20~25℃暗处放置20分钟,用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定, 至近终点时加淀粉指示液,继续滴定并强力振摇,至蓝色消失;

另精密量取供试品溶液5ml,置碘瓶中,加醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5)5ml,精密加入碘滴定液(0.01mol/L)15ml,密塞,摇匀, 在暗处放置20分钟,用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定,作为空白.同时用青霉素钠对照品同法测定作对照,算出供试品的含量. V样空 V样 对照液 +缓冲液+碘液+回滴+碱+酸+缓冲液+碘液+回滴 V对空 V对 供试液 +缓冲液+碘液+回滴+碱+酸+缓冲液+碘液+回滴 2.方法 空白试验 A、消除样品已降解产物的干扰B、消除样品中其他消耗碘的杂 质的干扰C、消除碘挥发造成的误差 以未经水解的样品作空白测定 空白 样品 I2 Na2S2O3 I- I2 采用标准品平行对照测定 A、可消除温度、pH、操作、环 境等条件的影响B、使本法测定结果与微生物检定 法一致 3.条件(1)弱酸性 pH4.5碱↑ I2 → IO3- + I-酸↑普鲁卡因与碘在酸性条件下会产生复盐沉淀(2)温度 24~26℃温度>

38 ℃未水解的供试品亦消耗碘 (3)水解时间以水解20分钟后的耗碘量最大(4)反应时间反应20分钟后,耗碘量随时间的变化较小,可减小含量测定的误差. (1)灵敏度高 样品 : 碘=1:8(2)反应条件、实验操作要求高 V对、V对空V样、V样空 1份含量 4I2→8I- 4.特点 加试剂次序、反应时间、滴定速度相同 5.计算 原料 降解产物或杂质可消耗碘而影响测定,因此用未经水解的样品做空白.碘量法是青霉素族的经典的测定方法. 1. 原理 (水解) ChP 青霉素族

(二)电位配位滴定法(汞量法) 2.方法 醋酸盐缓冲液 pH4.6 滴定 水解 pH4.6 滴定 样品 以未经水解的样品作空白测定 例 苯唑西林钠 含量测定 取本品约50mg,精密称定,加水5ml溶解后,加1mol/L氢氧化钠溶液5ml,摇匀,放置15分钟,加1mol/L硝酸溶液5ml,醋酸盐缓冲液(pH4.6)20ml及水20ml,摇匀, 照电位滴定法(附录Ⅶ A),用铂电极为指示电极,汞-硫酸亚汞电极为参比电极,在35~40℃,用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)缓慢滴定, (控制滴定过程约为15分钟),不计第一个等当点,计算第二个等当点时消耗滴定液的量.每1ml硝酸汞滴定液(0.02mol/L)相当于8.029mg的总苯唑西林(按C19H19N3O5S计算). 另取本品约0.5g,精密称定,加水与上述醋酸盐缓冲液各25ml,振摇使完全溶解,在室温下,立即用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)滴定,终点判断方法同上. 每1ml硝酸汞滴定液(0.02mol/L)相当于8.029mg的降解物(按C19H19N3O5S计算).总苯唑西林的百分含量与降解物的百分含量之差值即为苯唑西林的含量.

3、讨论(1)水解必须完全(2)空白试验 消除已降解产物干扰(4)优点 不需标准品(2)反应摩尔比

1 :

1

4、计算 (1)原理 (咪唑) ChP 青霉素族

(三)可见-紫外分光光度法

1、硫醇汞盐法 咪唑 (2)方法 对照品法 计算 pH

9 例 氨苄西林钠 含量测定(参考教材277) 取本品约60mg 置100ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取5ml,置另一100ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,再精密量取5ml,置25ml量瓶中,加硼酸缓冲液2.5ml与醋酐的乙腈溶液(1→50)0.25ml,放置5min后,加咪唑溶液至刻度,摇匀,置60℃水浴 中,加热30min,取出冷却,照分光光度法(附录Ⅳ A ),在325nm的波长处测定吸收度;

另取氨苄西林三水合物标准品,按同法测定,计算,即得. (3)讨论 咪唑催化的水解产率高,硫醇汞盐稳定(≥3h) b. 侧链有-NH2时,需加醋酐先 将其乙酰化后才能发生上述反应 pH9 (4)特点 A、简便快速B、用标准品对照,重现性良 好,RSD≤1% (水解) 稳定剂 青霉素族

2、酸水解法(铜盐法)(1)原理 (2)方法 (3)特点 实验条件随各药物稳定性不同而定 标准品对照法 (4)计算 Fe3+/3 H+ 红色 β-内酰胺类 NaOH

3、羟肟酸比色法

(四) HPLC法 头孢菌素类内标法+校正因子 外标法 特点 快速、高效、灵敏 专属性强、重现性好一法多用(鉴别、检查、含测)

五、生物样品中B-内酰胺类抗生素分析人血浆中阿莫西林浓度测定C18,

第三节 氨基糖苷类抗生素 链霉素 双氢链霉素新霉素 卡那霉素庆大霉素 巴龙霉素 链霉胍 + 链霉糖 + N-甲基-L-葡萄糖胺 苷元 糖 链霉双糖胺 链霉素 链霉胍 链霉糖 N-甲基-L-葡萄糖胺 链霉胍 链霉糖 N-甲基-L-葡萄糖胺 糖 苷元 绛红糖胺 + 脱氧链霉胺 + 加洛糖胺 糖 庆大霉素 绛红糖胺 紫素胺 2-脱氧链霉胺 加洛糖胺 N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺 庆大霉素C复合物 庆大霉素C1 R=H R

1、R2=CH3 庆大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 庆大霉素C1a R、R

1、R2=H 庆大霉素C2a R=CH3 R1= R........