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磁纳米・微萃取:为生命科学提供自动化磁纳米捕获方案

1 生化科技 Enriching Biotechnology 使用说明书 【产品名称】Protein A 琼脂糖磁珠 【产品型号】MAg25K/Protein A 【目录号】P24 【产品介绍】 Enriching Beads? Protein A 琼脂糖磁珠以交联琼脂糖为基质, Protein A 被在磁性微球表 面.

与同类产品相比,Enriching Beads? Protein A 琼脂糖磁珠表面具有更多的抗体结合 位点.在IP 实验中,只需使用更少的磁珠量,非特异性结合低,使用简便有效,具有大 面积特异的表面区域,从而大大缩短抗体吸附和抗原结合的时间,可以在

30 分钟内完成 完整的 IP 实验.此产品适用的范围广泛,例如细胞裂解液、细胞分泌液上清、血清、动 物腹水. 【产品规格】 平均粒径 25?m 固形物浓度 10% (v/v) 分散液 PBS, pH 7.4, 0.1%BSA,0.02%NaN3 抗体结合量 20~30mg Human IgG/mL (100% v/v) 【产品特点】 ? 抗体结合位点丰富;

? 非特异性吸附低. 【作用对象】适用于细胞裂解液、细胞分泌液上清、血清、动物腹水以及其它的免疫抗 原等. 【有效期】1 年(2~8 ℃保存) 【操作流程 】 缓冲液 配方 Binding/Wash Buffer PBST, pH 7.4: PBS with 0.02% Tween-20 NP40 Cell Lysis Buffer 150mM NaCl, 1% NP40, 50mM Tris, pH 7.4 Elution Buffer 100mM Glycine, pH 2.8 Neutralization Buffer 1M Tris-HCl, pH 8.5 抗原样品制备 本操作说明书提供以下四种样品处理方法,建议您根据不同来源的抗原样品选择适 磁纳米・微萃取:为生命科学提供自动化磁纳米捕获方案

2 生化科技 Enriching Biotechnology 当的方式进行预处理,使待检测抗原释放至样品溶液中. 血清样品处理:若目标蛋白丰度较高,建议用 Binding Buffer 稀释血清样品至目标蛋 白终浓度为 10~100 ?g/mL,置于冰上备用(或置于-20℃长期保存). 悬浮细胞样品处理: 离心收集细胞 (4℃,

500 g,

10 min) , 弃上清后称重, 按1.0?105 个细胞 20~30 ?L 的比例加入 PBS 洗涤

2 次;

按1.0?105 个细胞 20~30 ?L 的比例加入 NP40 Cell Lysis Buffer,同时加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为

1 mM 的PMSF),混匀 后置于冰上处理 10min;

离心收集上清液(4℃,14000 g,10 min),置于冰上备用(或置 于-20℃长期保存). 贴壁细胞样品处理:移去培养基,用PBS 洗涤两次;

用胰酶消化或者细胞刮刀,收 集至 1.5 mL 离心管内, 按1.0?105 个细胞 20~30 ?L 的比例加入 PBS 洗涤

2 次;

按1.0?105 个细胞 20~30 ?L 的比例加入 NP40 Cell Lysis Buffer,同时加入蛋白酶抑制剂(如终浓 度为

1 mM 的PMSF) , 混匀后置于冰上处理 10min;

离心收集上清液 (4℃,

14000 g,

10 min),置于冰上备用(或置于-20℃长期保存). 大肠杆菌样品处理:离心收集大肠杆菌(4℃,

12000 g,

2 min),弃上清后称重,按 每克(湿重)菌体

10 mL 的比例用 PBS 洗涤

2 次;

按每克(湿重)菌体 5~10 mL 的比 例加入 Binding Buffer,同时加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为

1 mM 的PMSF),重悬菌 体,超声裂解细胞,离心收集上清(4℃,

17000 g,

10 min). 磁珠预处理 1. 移液器吹打或漩涡振荡器混匀磁珠, 取50?L 磁珠悬浮液(10%,v/v)至离心管中, 1.5mL 磁力架磁性分离去除保存液;

注:客户可根据实际需要适当增减;

2. 加入

100 ?L PBS 混匀磁珠(颠倒

30 秒或者旋涡振荡器混匀),磁性分离去除上清 液(重复

2 次);

抗体结合 1. 用100?LPBST 稀释 2~20?g 抗体样品,稀释后加入到装有磁珠的离心管中;

注:实际抗体使用量需根据实验摸索,可参看磁珠对应不同抗体亚型的亲和力表;

2. 将上述混合物放入摇床或旋转混合仪室温或 37℃颠倒混匀或者涡旋混匀 10~15 分钟;

3. 将装有磁珠和抗体的离心管放入磁力架,待磁珠完全贴壁后,去除上清液;

4. 用100?LPBST 洗涤磁珠-抗体复合物

3 次. 抗体交联反应 (备选) 如操作者需要将抗体和目标抗原复合物共同洗脱, 请忽略本步骤, 直接进行下一步骤;

本步骤适用于操作者需要单独洗脱目标抗原的试验,推荐使用 BS3(Thermo Scientific, Cat. #21580)作为交联剂,相关实验请参照该试剂的操作说明. 抗原沉淀反应 磁纳米・微萃取:为生命科学提供自动化磁纳米捕获方案

3 生化科技 Enriching Biotechnology 1. 抗原吸附:向上一步装有磁珠-抗体复合物的离心管中加入制备好的细胞裂解液 100~1000?L,用移液枪吹打混匀;

2. 37℃颠倒混匀或者低速涡旋混匀 15~20 分钟,使抗原和结合抗体的磁珠结合;

注:为使集合更充分,孵育时间和稳定可根据实际需求进行调整;

3. 将上一步的离心管和混合物放入磁力架,吸取上清(上清可丢弃也可保存做后续分 析);

4. 取200?L PBS 洗涤磁珠-抗体-抗原复合物

3 次;

5. 洗涤完成后用 100?L PBS 重悬磁珠,用于下一步操作. 注:抗原洗脱前务必将磁珠转移新的离心管,避免将管壁上原有的非特异性吸附蛋白一起洗脱 抗原洗脱 本操作说明书提供以下两种抗原洗脱方案,操作者可根据后期检测的需要选择不同 的抗原洗脱方法. 变性洗脱法: 1. 将装有磁珠-抗体-抗原复合物的离心管放入磁力架,待磁珠贴壁完全后吸去上清;

2. 向上述离心管中加入25?LElution Buffer和5?L 5x SDS-PAGE Loading Buffer (自备) 再用移液器重悬复合物;

3. 95~100℃煮沸5~10分钟;

4. 将煮沸后的离心管放入磁力架取上清做后续分析(注:上清液中含有抗原勿丢弃). 非变性洗脱法: 1. 将沉淀抗原第5步骤中的磁珠放入磁力架,磁性分离去除上清液;

2. 向离心管中加入约30?L的Elution Buffer,用移液器轻轻混匀避免气泡产生,颠倒混匀 或者低速涡旋混匀2~5分钟;

3. 将磁珠放入磁力架,磁性分离收集上清(注:上清液中含有抗原勿丢弃);

4. 中和:上述步骤收集上清中抗原,若需做功能验证需加入Neutralization Buffer中和洗 脱液(例:100?LElution Buffer加入10 ?L Neutralization Buffer即可). Target Antigen Detection(沉淀后抗原分析) A. 变性洗脱抗原适用方向 1. 蛋白染色鉴定 2. Western blotting 3. SDS-PAGE for Fluorography B. 非变性洗脱抗原适用方向 1. 蛋白特征分析 2. 免疫 磁纳米・微萃取:为生命科学提供自动化磁纳米捕获方案

4 生化科技 Enriching Biotechnology 3. 酶学研究 4. 氨基酸序列分析 5. 蛋白晶体结构分析 C. 未做洗脱抗原适用方向 1. 蛋白相互作用 2. 酶学研究 3. 生物分析 4. 免疫学分析 【磁珠再生】 1. 磁珠多次使用后会有沉淀蛋白、 强疏水性蛋白、 脂蛋白等杂质非特异性吸附到磁珠上, 为了保证磁珠的使用效率,建议持续使用

5 次后进行磁珠再生处理. 2. 按约每

1 mL 10%(v/v) 磁珠加入

1 mL 1%(v/v)Triron X-100 磁珠再生缓冲液, 振荡均匀,在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转混合,10 min 后进行磁性分离, 弃上清液. 3. 立即加入

1 mL Binding/Washing buffer 进行重悬,然后磁性分离,弃上清液,重复该 操作

3 次. 4. 加入

1 mL Storage buffer 重悬磁珠 ,置于 2~8℃保存. 【注意事项】 1. 进行免疫沉淀操作之前,请务必认真阅读本操作说明书;

2. 本产品须与磁性分离器配套使用;

3. 磁珠应保存在储存溶液中,防止干燥;

4. 请勿将磁珠冷冻或离心,以免引起不可逆聚集;

5. 为保证最佳的实验结果,请选择特异性较强的抗体进行免疫沉淀反应;

6. 操作者可根据实际需求,利用抗体结合反应步骤以及抗原结合反应步骤中收集的上清 液检测抗体、抗原和磁珠的结合情况;

7. 对于 IP 实验,不同类型的抗体与抗原结合的亲和性是有区别的,抗体与抗原结合还会 受到结合缓冲液和洗涤缓冲液的影响,因此,如果操作者使用本试剂盒提供的缓冲体系 不能获得很好的实验结果,可自行筛选及配制缓冲液进行实验;

8. 本磁珠表面包被的重组蛋白 Protein A 在极端条件下(如低 pH、加热处理)存在极低 的蛋白脱落情况;

9. 不建议操作者用于分子量约

130 kD 目标蛋白的免疫沉淀实验;

10. 本产品仅供研究使用. 磁纳米・微萃取:为生命科学提供自动化磁纳米捕获方案

5 生化科技 Enriching Biotechnology 【常见问题与解答】 Q1:如何提高抗体与磁珠结合效率? A1:磁珠与抗体的结合效率与抗体的种属来源及所属亚型有关,请确认抗体的类型与 Protein A 配基的亲和效率(附表 1).增加抗体与磁珠的孵育时间(30~120 min)、提 高结合缓冲液的 pH 值(8~9)及降低离子强度(25~100 mM NaCl)等方法可提高亲和 效率. Q2:如何提高磁珠在免疫沉淀反应中的特异性? A2:抗体与样品进行孵育,形成抗体-抗原复合物,再用 Protein A 磁珠捕获复合物.这 种方法可以提高抗体与抗原的结合效率,并降低磁珠与样品接触的时间,从而提高沉淀 产物的特异性.对于 ChIP&

CoIP 也推荐使用此法. Q3:如何提供抗体洗脱效率? A3: 抗体与 Protein A 配基亲和度太高导致抗体洗脱效率低, 可以通过降低洗脱缓冲液的 pH 值(1.9~2.5)、增大洗脱缓冲液的离子强度(可选用 2~3 M MgCl2)或延长洗脱时 间,提高抗体的洗脱效率.但应注意抗体在低 pH 条件下容易形成聚集物,抗体洗脱产物 应马上用碱性缓冲剂(如Tris、HEPES 等)调节 pH 至中性. 磁纳米・微萃取:为生命科学提供自动化磁纳米捕获方案

6 生化科技 Enriching Biotechnology 附表一:Protein A,G,L 与不同来源类型的抗体亲和性比较: 种类 Species 亚型 Antibody Class 蛋白 A Protein A 蛋白 G Protein G 蛋白 L Protein G Human IgG IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgM + - +++ IgD - - +++ IgA Mouse IgG1 + ++ +++ IgG2a IgG2b IgG3 IgM - - +++ Rat IgG1 + ++ +++ IgG2a IgG2b - + IgG2c Cow IgG1 + +++ - IgG2 Goat IgG1 + +++ - IgG2 Horse IgG(ab) + - NA IgG(c) + - NA IgG(T) - +++ NA Rabbit IgG Pig IgG +++ + + Dog IgG Chicken IgY - - NA 英芮诚生化科技(上海)有限公司 地址:上海市杨浦区翔殷路

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