PDF《第21 卷1期》

58 中国病毒学第21 卷 虫剂,并从细胞和分子水平研究病毒的生物学特 性,基因的结构和功能,进一步通过遗传工程的 途径改良病毒杀虫剂的杀虫效果是昆虫病毒学研 究的重要内容[5~7] . 多角体衍生病毒粒子(Polyhedron-derived virus, PDV) 的囊膜在昆虫中 肠内病毒感染的起始过程以及细胞内多角体蛋白 与PDV 结合中起重要作用.GP41 糖蛋白是 PDV 囊膜的结构蛋白,囊膜蛋白与包涵体的形成、病 毒入侵宿主等有密切关系[8] .SpltMNPV 基因组 中,许多重要基因的结构和功能还不清楚,该病 毒gp41 基因的研究在国内外未见报道.本研究利 用斜纹夜蛾培养细胞,在克隆斜纹夜蛾日本分离 株(C3)多角体蛋白基因(polyhedrin , ph)的基础上 [9] ,进一步克隆了 gp41 基因,分析了该基因的结 构特征,进行了 gp41 和ph 的分子系统发育分析. 另外还构建了含 gp41 基因的原核表达载体,在大 肠杆菌中表达了该基因.

1 材料和方法 1.1 实验材料 本研究所用的 SpltMNPV 由日本岐阜县生物产 业技术研究所 Katsumi Kamiya 博士馈赠, 斜纹夜蛾 TUAT-Spli221 细胞由日本名古屋大学资源昆虫研 究室 Michihiro Kobayashi 教授提供,苏州大学生命 科学学院细胞与分子生物学教研室保存.Spli 细胞 用含 10%胎牛血清 (Invitrogen 公司)的TC-100 培养基(Invitrogen 公司) ,28℃培养.载体质粒 pMD18T Vector 为Takara 公司产品,原核表达载体 pET28a、大肠杆菌 DH5α、BL21(DE3)由本实 验室保存. 1.2 病毒感染 培养的单层贴壁细胞根据朱江等的方法进行 病毒感染[9] ,28℃培养 96h 后收取病毒感染的培养 细胞.从感染的培养细胞提取病毒 DNA 的方法根 据吴福泉等[10] 的方法进行. 1.3 分子克隆 以GenBank SpltMNPV 中国株(G2)基因组全序 列(NC003102)gp41 基因读码框 5'

及3'

端非编码 序列设计一对引物 (上游引物 5'

AAGGCGAGAAT AGATT 3'

,下游引物 5'

CAATCGGCACCCTCTT 3'

) .以SpltMNPV 日本分离株(C3)基因组 DNA 为 模板进行 PCR 扩增.回收 PCR 产物,将其与克隆 载体 pMD18T 连接,构建的重组质粒为 pMD18T- gp41. 原核表达引物为:上游引物 5'

-GCGGATCCAT GAACAACGGTGGTGGA-3'

, 酶切位点为BamHⅠ, 下游引物 5'

-GCAAGCTTCATTG TTGCTGTTGCG T-3'

,酶切位点为 Hind Ⅲ.以pMD18T-gp41 为模 板PCR 扩增 gp41 的编码区.回收 PCR 产物,用BamHⅠ和Hind Ⅲ分别双酶切该片段及原核表达 载体 pET28a, 并连接酶切产物, 构建重组表达载体 pET28a-gp41. DNA 分离片段、连接转化、质粒制备与纯化、 限制性核酸内切酶酶切均按 Sambrook [11] 等方法进 行. 1.4 gp41 基因在大肠杆菌中的融合表达 将pET28a-gp41 转化 BL21(DE3),用IPTG 浓 度为 1.0mmol/L 诱导表达目的蛋白,诱导时间分别 为1h,2 h,3 h,4 h.用15%SDS-PAGE 进行电泳 分析. 1.5 序列测定和序列分析 序列测定委托上海博亚生物技术有限公司进 行,对测得的序列用 BLAST 软件搜索 GenBank database 中的同源基因,用CLSTUAL、MEGA 软 件进行多重联配比较及同源性分析.用PHDsec 进 行蛋白质二级结构分析.应用 MEGA 中Kimura-2p 模型计算遗传距离,邻接法(Neighbor-joining, NJ) 和最大简约法(Maximum Parsimony,MP)构建分 子系统树,枝长表示分歧度,枝上的数值是bootstrap1000 次后的置信度. 1.6 计算 gp41 及ph 的突变率的方法 应用 Kestim60 软件的 Kimura-2p 参数, 分别两 两比较了