PDF《真空渗透法转化油菜及转化种子的筛选》

50 mg・L-1 Km的MS选择培养基上. 密度为300粒,瓶.25.C暗培养2天后,每天光照12 小时培养3―4天.将正常生长的绿色苗在距生长点1― 1.5 cm处切下,插入新的相同MS选择培养基中继续筛 选2―3代,每2―3周继代1次. 万方数据 218植物学报 (2)2009 1.2.4 抗性檀株的PCR检测 油菜基因组DNA提取参照王灏等(2001)的方法.扩增 pKART.AP3内35S启动子的引物序列:F,5'

一ACCCACAGATGGTTAGAGAGGC-3'

:R,5'

. CTCTCCAAATGAAATGAACTTC-3'

.在20¨L PCR 反应体系中含有1*PCR buffe r、1.2 mmo|.L_1 MgCl

2、0.2 mmol・L-1 dNTPs、1.0 U丁aq酶、0.2 ¨mo卜L-1正反向引物以及约15 ng模板DNA.PCR反 应程序:94.C 3分钟:94.C 60秒,56.C 60秒,72.C

90 秒,40个循环:72.C延伸10分钟:4.C下贮存直至电泳 分析.扩增产物在1.4%(w,V)的琼脂糖凝胶(含1 pg・ mL_1 EB)中电泳(1*TAE buffer,5 V・cm-1),紫外透射 仪检测并照相.

2 结果与讨论 2.1 卡那霉素对油菜种子发芽及其生长发育的 影响 由于油菜繁殖系数高,真空渗透转化的假阳性率也很高, 收获的种子不可能全部进行分子检测,所以抗性筛选尤 为重要.而抗性筛选中抗生素致死浓度的确定非常关 键,如果抗生素浓度过高会使转化体也被淘汰,过低则 造成非转化体逃逸而带来过多的假阳性.种子的抗性 又与再生体的抗性不同,而且不同品种的抗性也不一 样,所以必须首先确定各品种(系)种子的抗生素最低致 死浓度. Km在0―150 mg・L-1浓度范围内对油菜种子的萌 发影响不显著,各处理的发芽率均高达98%以上,但对 其生长发育具有明显的抑制作用(图1A,B).随着Km 浓度的增加,其抑制作用加强.种子消毒后直接播种于 含相应浓度Km的筛选培养基中,与对照相比.3个品种 的主根长度均随Km浓度的增加而下降,并且均与对照 达到极显著差异水平(图1A).陕3B和M923两个品种 的下胚轴长度随Km浓度的增加而下降,而L45在Km 浓度为30 mg.L_1时下胚轴长度比对照有轻微的增加, 之后随Km浓度的增加而下胚轴长度减少,表明低浓度 Km对L45的下胚轴伸长有促进作用(图1 B). 种子消毒后在含相应浓度Km的水溶液中4.C浸泡 40小时.然后播种于含相同浓度Km的筛选培养基中, 结果表明3个品种的主根和下胚轴长度均随Km浓度的 增加而减少(图1A,B).主根长度在Km浓度为30 mg・ L-1时即与对照达到极显著差异水平(图1 A),而下胚轴长 度只有在Km浓度达到1

00 mg-L_1时才与对照达到显著 差异水平(图1 B).同时浸泡处理组的主根长度除对照 外均比同品种直接播种组的主根长度短(图1A),而浸泡 处理组的下胚轴长度,在0―100 mg-L-1Km浓度范围内 比同品种直接播种组的长,只有当Km浓度达到1

50 mg・L-1时比同品种直接播种组的短(图1 B),表明Km对 种苗主根生长的影响要大于对下胚轴伸长的影响. 图1 卡那霉素对油菜子叶苗主根IA}和下胚轴IBl生长的影响 z:种子未经卡那霉紊溶液浸泡直接播种于培养基:P:种子经卡那 霉索溶液浸泡后播种于培养基 Figure

1 Effect of kanamycin on the growth of tap root IA) and hypocotyls lBl of 8,冒ss,ca,'

apl,s seedlIng Z:Seeds were sOwn in the medium directIy withOut sOaking in the kanamycin sOIution:P:Seeds were sOwn in the medium after sOaking jn the kanamycin sOIutiOn 万方数据 在子叶颜色变化方面,对Km浸泡处理5天后的野 生型材料进行统计,结果发现:不同油菜品种的Km致死 浓度不同(图2).经浸泡处理5天,L45在Km筛选浓度 为150 mg・L-1以上时幼苗全部黄化或紫化死亡,Km浓 度在50 mg-L.1及以下时的油菜种苗生长状况基本正常, 部分子叶出现黄化:Km浓度在100 mg-L-1时,油菜幼 图2 不同油菜品种对卡那霉素的敏感性分析 Z:种子消毒后不经卡那霉素浸泡处理直接播种于含相应浓度卡那 霉素的培养基:P:种子消毒后经卡那霉索水溶液浸泡处理后再播 种于含相应浓度卡那霉素的培养基 Figure