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488 Imaging Kit 使用说明书

4 可采用

2 小时孵育时间.不同细胞类型的孵育时间可参考如下表 1. 表1:EU 孵育时间参考表 细胞类型 人胚胎细胞 酵母细胞 人成纤维细胞 人宫颈癌细胞 人胚肾细胞 人神经细胞 细胞周期 ~30 min ~3 h ~18 h ~21 h ~25 h ~5 d 孵育时间

5 min

20 min

2 h

2 h 2h

1 d 2. 细胞固定、透膜处理 注意:本实验操作采用含 3.7%甲醛的 PBS 进行细胞固定,含0.5% Triton X-100 的PBS 进行 细胞透膜处理.但是,其它的细胞固定及透膜方法比如甲醇、皂素等同样适用于本实验操作. 2.1 移除细胞培养液,往含盖玻片的多孔板里每孔加入

1 ml 细胞固定液(含3.7% 甲醛的 PBS ),室温孵育

15 分钟. 2.2 移除细胞固定液,每孔加入

1 ml 含3% BSA 的PBS 清洗细胞

5 分钟,重复一 次. 2.3 移除细胞清洗液,每孔加入

1 ml 细胞透膜液(含0.5% Triton X-100 的PBS ), 室温孵育

20 分钟. 3. EU 检测 注意:本实验操作采用

100 μl iClick 反应液体系,也可按实际需求使用更大或更小体积的 iClick 反应液体系,但须保证配置的反应液中各试剂组份保持同一个比例. 3.1 配制 10*iClick EU 缓冲添加剂.取试剂盒组份 E,加入 1ml 去离子水,颠倒 混匀直到溶质完全溶解. 使用后建议储存剩余的缓冲添加剂于-20℃或更低温度, 可 以稳定保存至少

1 年以上.如果溶液变成棕黄色,说明该试剂发生降解,则需更换. 3.2 配制 1*iClick EU 缓冲添加剂.用去离子水做

10 倍稀释 10*iClick EU 缓冲添 加剂.现用现配. 3.3 配制 1*iClick 反应液体系,按照如下表

2 的顺序依次配制,否则无法达到最佳 的使用效果.注意反应液体系需在

15 分钟之内使用. 表2:1* iClick 反应液体系配制参考 试剂 盖玻片数量

5 10

20 50 iClick EU reaction buffer(组份 C)

430 μl

860 μl 1.8 ml 4.3 ml CuSO4(组份 D)

20 μl

40 μl

80 μl

200 μl Andy Fluor

488 azide(组份 B) 1.5 μl

3 μl

6 μl

15 μl 1* iClick EU 缓冲添加剂(步骤 3.2)

50 μl

100 μl

200 μl

500 μl 总体积

500 μl

1 ml

2 ml

5 ml 3.4 移除细胞透膜液,每孔加入

1 ml 含3% BSA 的PBS 清洗细胞

5 分钟,重复一 iClick? EU Andy Fluor

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5 次.移除细胞清洗液. 3.5 每孔加入

100 μl iClick 反应液.确保 iClick 反应液均匀覆盖整个盖玻片. 3.6 室温孵育

30 分钟,注意避光. 3.7 移除 iClick 反应液,每孔加入

1 ml 含3% BSA 的PBS 清洗细胞

5 分钟,重复 1~2 次.移除细胞清洗液. 注意:某些细胞对染料的吸附性较强,会导致较高的背景信号,为降低染料背景信号,可采用 甲醇清洗 1~2 次,每次

5 分钟.然后用含 3% BSA 的PBS 清洗

5 分钟. 如需做细胞核复染,请按 DNA 染色步骤操作.如不需要额外的染色,即可将上述 盖玻片封片后直接在荧光显微镜观察及成像分析. 4. DNA 染色 4.1 每孔加入

1 ml PBS 清洗细胞,移除细胞清洗液. 4.2 配置 1*Hoechst

33342 染色液. 取出试剂盒组份试剂 F, 使用 PBS 按1:1000 比例稀释.1*Hoechst

33342 染色液的终浓度为

5 μg/ml. 4.3 每孔加入

200 μl 1*Hoechst

33342 染色液.室温孵育

15 分钟,注意避光.移除Hoechst

33342 染色液. 4.4 每孔加入

1 ml PBS 清洗细胞

5 分钟,重复一次.移除细胞清洗液. 5. 成像及分析 将盖玻片晾干后,用封闭液在载玻片上封片,盖玻片四周用指甲油密封.根据如下 表3染料的荧光激发和发射波长选择合适的激发光源和滤光片,荧光显微镜观察. 表3:荧光染料激发/发射波长 荧光探针 激发波长(nm) 发射波长(nm) Andy Fluor