PDF《鱼类肠道微生物总 DNA的提取》

3h 内转移到实验室,

1 2h内处理鱼样.在 无菌操作台上进行鱼样处理, 先用

7 5 %酒精擦拭鱼 体表, 用解剖剪沿肛门向上朝前呈弧形剪开.7

5 % 酒精擦拭消化道外壁, 无菌冲洗液(

0 .

9 %灭菌生理 盐水) 冲洗数遍( M a c D o n a l d ,

1 9

8 6 ) .用剪刀分离出 消化道, 分别用 4个2m L离心管收集消化道内容 物, 标记为

1 、

2 、

3 、

4 , 于-20℃保存.

1 .

2 试剂 D N A提取试剂盒(E.Z.N.A.BacterialD N A K i t ) 购自美国 O m e g a生物技术公司, T a q酶、 D N A M a r k购自购自广东东盛生物科技生物科技有限公 司, 琼脂糖购自上海生物科技有限公司.

1 .

3 方法

1 .

3 .

1 样品前处理 将采集的 4组样品分别用

1 5m LP B S ( p H7 .

4 , 浓度

0 . 2m o l / L ) 悬浮, 剧烈震 荡5m i n 后,

10 0 0r / m i n 离心 3次, 每次 5m i n , 收集 上清, 然后

1 20

0 0r /m i n离心 5m i n , 收集菌体沉 淀, 用1mLP B S 悬浮沉淀, 重复离心, 直到上清液基 本清澈为止;

最后再用 1m LP B S悬浮收集到的沉 淀, 置于 2m LE p p e n d o r f 管中 -

2 0 ℃保存备用.

1 .

3 .

2 肠道微生物总 D N A的提取 将上述处理的 样品,

1 20

0 0r / m i n离心 5m i n , 去除上清液.参考 Y u&

M o r r i s o n (

2 0

0 4 ) 的方法略加修改, 增加 D N A试 剂盒纯化步骤, 按试剂盒( O m e g a ,U S A ) 操作步骤, 所得产物存放于 -

2 0 ℃备用.具体操作步骤如下: (

1 ) 在上述处理的样品中各加入

1 8 0μ LT E缓 冲液, 再加入

5 0m g / m L的溶菌酶

2 0μ L , 混匀后置

3 0 ℃温育最少

1 5m i n . (

2 )

1 2

0 0 0r / m i n 离心

5 m i n , 收集已消化细胞壁 的细菌. (

3 ) 加入

2 0 0μ LB u f f e r B T L重悬细胞, 加25μ L 蛋白酶 K (

1 5m g / m L ) , 加入玻璃珠, 涡旋混匀, 置于

5 5 ℃恒温水浴, 每20~

3 0m i n涡旋振荡样品 1次. 裂解时间随细菌的种类及用量的不同而不同, 但一 般在 1h 之内就能消化完全. (

4 ) 加入

2 5m g / m L的RNA酶 A5μ L , 并在室 温下放置 5m i n . (

5 ) 加入

2 2 0μ LB u f f e rB D L , 涡旋混匀, 并在

6 5 ℃下水浴

1 0m i n .在加入 B u f f e r B D L后可能会形 成小团的沉淀, 并不会影响 D N A的提取. (

6 ) 加入

2 2 0μ L无水乙醇并充分地涡旋振荡. (

7 ) 把HibindL自旋柱装在 1个2m L收集管 上, 把第 6步得到的样品( 包括可能形成的所有沉 淀) 全部转移到柱子内,

1 00

0 0* g 离心

1 m i n 以结合 D N A , 弃去流出液和收集管. (

8 ) 把柱子装到 1个新的 2m L收集管上, 加入

5 0 0μ LH B , 加入

7 0

0 μ LD N AWa s hB u f f e r ( 已用无水 乙醇稀释) 于柱子中,

1 00

0 0*g 离心 1m i n以洗涤 柱子, 弃去流出液, 收集管再继续下一步使用;

柱子 重新套回 2m L收集管, 加入

7 0 0μ LD N A Wa s h B u f f e r ,

1 00

0 0* g 离心 1m i n以洗涤柱子, 弃去流出 液. (

9 ) 柱子重新套回 2m L收集管, ≥1

00 0 0*g 离心空柱 2m i n以甩干柱子;

这一步对确保下步中 得到最理想的洗脱条件是至关重要的. (

1 0 ) 把柱子套在

1 . 5m L离心管中, 加入

1 0

0 μ L6

5 ℃预热的 T E ( p H8 .

5 ) 至柱子的膜中央, 室温 下放置 5m i n . (

1 1 ) 室温下,

1 00

0 0* g 离心 1m i n 从柱子上洗 脱出 D N A .

1 .

3 .

3 肠道微生物总 D N A的电泳检测 以水作为 空白对照, 取水和产物各 5μ L经1.5%琼脂糖凝胶 电泳后, 用凝胶成像仪( T a n o n4