PDF《不同电转仪的电转参数、质粒用量和拓扑结构对》

830 have the highest transfection efficiency when transfecting

10 μg supercoiled plasmids into PFFs, and

8 μg for NEPA 21. Supercoiled plasmids show higher transfection efficiencies than linearized plasmids. Moreover, Nu- cleofector? 2b has the highest transfection efficiency among the three electroporation instruments. This study paves the way to generate transgenic or gene editing pigs with high efficiency. Keywords: electroporation;

porcine fetal fibroblasts(PFFs);

ECM? 830;

NEPA 21;

Nucleofector? 2b 随着转基因技术的发展,转基因猪的制备体系 逐渐完善,但是制备效率低下仍然大大限制了转基 因技术的应用.研究表明,转基因效率与猪体细胞 克隆的供体细胞有关[1] ,而目前猪胎儿成纤维细胞 (porcine fetal fibroblasts, PFFs)是使用最广泛的猪体 细胞克隆供体细胞. Liu 等[2] 对比 PFFs、 成体成纤维 细胞、猪成体脂肪前体细胞和猪成体血间充质细胞 的克隆效率发现,虽然 PFFs 的囊胚率为 30.38%, 低于其他几种细胞(成体成纤维细胞、猪成体脂肪前 体细胞和猪成体血间充质细胞分别为 37.94%、 34.65% 和34.87%), 但是其怀孕率和克隆效率显著高于其他 细胞,分别为 74.19%和1.5%;

另外,PFFs 供体细 胞制备克隆胚胎后期发育异常率远低于其他几种细 胞(PFFs、成体成纤维细胞、猪成体脂肪前体细胞和 猪成体血间充质细胞分别为 10.87%、 56.57%、 24.39% 和51.85%).目前,已有多篇以 PFFs 细胞为供体的 转基因猪的报道,如2014 年Li 等[3] 运用 PFFs 成功 制备世界首例 ROSA26 定点基因敲入猪;

2016 年Lai 等[4] 通过 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术将 Oct4-tdTomato 报告基因转染至 PFFs 并成功制备基 因敲入猪.因此,研究 PFFs 细胞的制备效率对提高 转基因效率具有重要意义. 转染效率是限制转基因细胞制备的主要因素之 一,据报道 PFFs 的脂质体转染效率为 22.2%[5] .除 了脂质体转染法, 目前 PFFs 转染方法还包括碳酸钙 化学法和电穿孔法等.覃兆鲜等[6] 使用脂质体法和 碳酸钙法转染成功,获得 PFFs 阳性细胞,但转染效 率都比较低.与前两种方法相比,电穿孔法更适用 于PFFs 等难转染的细胞[7] .电穿孔法主要通过物理 电流击穿细胞膜甚至细胞核,形成瞬时孔隙,外源 DNA 可通过这些孔隙进入细胞甚至细胞核内[8] .这 种方法快速、简便易行、毒性小、转染效率较高, 转染效率在 30%~90%之间[9~11] ,而且不同的电转仪 的转染效率差别较大.电转仪种类繁多,例如早期 电转仪 ECM? 830(BTX,美国),近年来出现的新型 电转仪 NEPA 21(NEPA GENE, 日本)和Nucleofector? 2b(LONZA,德国)等.NEPA

21 高效基因转染系统 含有反向导入及电压衰减的电转程序设计,具有转 染效率高、 存活率高和不需要特殊转染试剂的特点. 而配合专用转染试剂盒的 Nucleofector? 2b 则具有 转染效率高、DNA 直接入核和简单易用的优势.目前ECM?

830 是运用比较成熟的电转仪,虽然可以 借鉴 Ross 等[9] 全面优化的 ECM?

2001 电转 PFFs 的 最佳参数(脉冲电压

300 V,脉冲长度

1 ms,脉冲次 数3次),但仍需进一步探索质粒的用量和拓扑结构 对PFFs 的转染效率的影响.虽然已报道了Nucleofector? 2b 转染 PFFs 的最佳程序,但是没有 进一步综合探讨电转程序、质粒的用量和拓扑结构 对PFFs 转染的影响[10] .此外,NEPA21 主要用于神 经干细胞体外电转染,但目前还没有报道用于 PFFs 的电转染[11,12] ,因此需要进行在电转参数、质粒的 用量和拓扑结构等方面的实验优化.本研究通过优 化不同电转仪的电转参数、 质粒的用量和拓扑结构, 综合评估电转 PFFs 的最佳电转仪及其电转条件, 为 高效率、低成本制备转基因猪奠定基础.