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4 张切片. 9. 去离子水清洗 2mins,三次. 10. 脱水:70%,85%,100%乙醇溶液中依次处理各

2 分钟,空气 干燥切片. 三.FISH操作步骤 警告和预防 荧光基团遇强光会产生光漂白现象.将含有荧光基团的试剂与玻片置于 暗处有助于减少此效应.所有不需光照的步骤(例如:孵育、洗涤等)均在 暗处进行. FISH 实验操作过程中请注意防护,试剂勿与皮肤直接接触.

(一)标本变性与杂交 1. 将含有的MDM2 /CEP12探针的杂交液从冰箱取出,瞬时离心, 用移液器吸10μl至各个样本.均匀滴加探针到整个目标区域;

或 者加探针到盖玻片中央,再将目标区域反扣到盖玻片上. 2. 样本盖上盖玻片(22 mm*22 mm),避免气泡;

封片胶封片. 3. 将玻片放入杂交仪中反应,80℃(± 2℃)变性6分钟,40℃过夜 杂交. 注意:杂交期间片子绝对不能干!

(二)杂交后的处理

1、提前30min将洗涤液I水浴加热到73± 1℃,小心除去封片胶.

2、将切片置于洗涤液II溶液中,放置5-10min,除去盖玻片.

3、将切片置于洗涤液I洗液(确保水浴加热到73± 1℃)中,上下提 拉切片1-3s,放置2mins.

4、室温条件下,将切片置于洗涤液II洗液中,上下提拉1-3s,处理 切片3mins.

5、在70%、85%的乙醇溶液中依次放置2mins. 6. 避光晾干样本. 注:洗液缸中每次最好同时放置4张切片,当最后一张玻片放入考 普林缸时开始计时.

(三)观察 1. 滴加10 μl DAPI复染液到切片组织上,避免气泡,盖上盖玻片, 用指甲油涂抹盖玻片边缘,暗处-20℃处理30分钟. 2. 于暗处保存切片.长期保存应放于-20℃. 3. 荧光显微镜下计数.

(四)储存 完成杂交的玻片置于-20℃避光储存.

五、 FISH检测结果分析 计数

30 个细胞,统计 Ratio 值(Ratio 值=30 个细胞核中红信号总 数/30 个细胞核中绿信号总数) .常见异常类型:MDM2 位点扩增

1、正常细胞:单个间期细胞核中红色及绿色信号各

2 个.

2、MDM2 基因扩增异常细胞:单个间期细胞核中红色信号大 于2,且绿色信号不少于

2 个. 结果分析注意事项:

1、样本需随机计数细胞.

2、计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞.

3、杂交不均匀的区域不要分析.

4、细胞核轮廓不清或有重叠的不要分析.

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5、背景深影响信号判断的区域不要分析.

6、计数结果需有两个参与人员独立完成,结果一致方可认定.

7、在分析石蜡切片时,分析的区域应在肿瘤细胞集中的部位(需 由病理科医师认定) .

8、如果超过 25%的细胞核内信号太弱,则该区域不要进行分析. 【参考范围】 MDM2 /CEP12 探针包含

2 种DNA 探针,在中期染色体与间 期核上均能杂交产生明亮的显微镜下肉眼可识别信号. MDM2DNA 探针杂交到人类

12 号染色体长臂(12q15), 荧光信号为红色.对 照探针为 CEP12, 探针杂交信号位于人类

7 号染色体 12p11.1-q11.1, 覆盖整个着丝粒区域,荧光信号为绿色. 当MDM2 /CEP12 比值≥2.0 为阳性结果,提示该样本 MDM2 基因 扩增;

当MDM2 /CEP12 比值2,即判定为 CEP12 多倍体[4] . 【检测方法的局限性】 本试剂盒采用荧光原位杂交技术用于脂肪肉瘤患者MDM2 基因扩增检测,不能用于其他基因突变方式的检测[4] . 【注意事项】

1、供体外检测使用.

2、本试剂盒实验操作过程中,需戴乳胶手套操作,避免试剂接触肌肤.如不 慎接触,立即用大量水冲洗.