PDF《薛小平徐志马文煜闫岩尹文》

5 H5 、

7 D1

2 、

7 C

1 1 、

7 D 1为抗 汉滩病毒NP型特异性Mc Ab ;

3 G1为抗救滩病毒 NP / G2双特异性Me A b;

1 3 E

2、

2 4 F

1 2为抗议城病毒NP型特异性Mc Ab ;

8 G2 、

8 G

3 、

8 F 8为抗 汉滩病毒GP Mc Ab ;

3 C

1 1为抗 GS T Mc A b .均为本室制备 ¨ .

1 .

3 汉坦病毒陈株 S 基因编码区 c D N A的获得 异硫氰酸胍一步 法从感染细胞裂解液中提取的总 R N A 为模 板,加入逆 转录引物 (

5 ' - ' r A G TA G T AG C A C C C G 一3),按Prornega公 司逆转录 K i t 说明操作台成cDN A 第一链 以 此为 一模 板 加入 P C R 引物 扩增目的 基因,实验中先后使用了3条 P C R 引物 : HS l : GC G AA T TC ATG GCA ACT ATG GAG GAA TTA

3 ;

HS

2 :

5 ' - GC GTC GAC TTA GAG TTT CAA AGG AGG CTC TTG G TT -

3 ;

:

5 ' - GC G AA q ' T C C C T G GA GAC C A T C TG A AA G AG-

3 引物 r t S l和H%含EcoRI 酶切位点.Hs

2 含Sail酶切位 点.1.4PCR产 物的 克 隆及 鉴定PCR产物 回收 纯化后甩EcoRI、Sail珊切.克隆八表达质粒pGE X一4T, l的 相应 位点.阳性 重组 子命 名为pGE X ― Ch e r t s1 . 3用EcoR1 、 X h o I 从该 质 粒上 切下

1 3 k b片段 , 亚 克隆 人测序质 粒r,GEM一

7 z f ( +) 的相 应 位点 , 阳性 重 组子 命 名为 p GE M― Ch e r t

1 3 .连接、转化阳性 克隆 的 筛选 及鉴定均 按文 献[5]进行 .

1 .

5 核苷 酸序列分 析 用魔 力柱 法 提取 重组测序质粒pGEM― C h e r t s

1 3 , 用垒自动荧 光DNA序列分析仪 , 从正 反 两十 方 面测 序.1.6汉坦 病毒陈株 S基 因在 大肠 杆菌 中 的表达 将含质粒 p G EX . C h e r t s1 3的菌种接 种在 5mL

2 x YT管中(含1%A mp , 下同),37℃ 振荡 培养过夜,以1100转 种100mL 2*YT继续培养2h.加入Olmmo l / L I P TG

2 5 0" L诱导4h.收集 苗体 , 重悬 于5mL GE T(

0 3mmo l / L蔗糖.25r et oo l / L E DT A

2 5mmo l / L' r r i s . HC I p H8

0 ) , 加 入终 浓度

2 % ( W/ V) 溶 菌酶 . 室温 作用

3 0 r ai n , 冻融 3次后,超声粉 碎,低速离 心取 上清进行 分 析鉴 定.17表达 产物 的分 析鉴定SDS―PAGE 、 we s 时nblotdng& E L1 S A参照文献 [

2 ] 进行 .

2 结果2.1逆转录 P C R结果 以cDNA 第一 链 为模 板,用引物 HS 和HS 2组配PCR扩 增得 到约13kb片段 .

2 .

2 S基 因编 码 区的序 析分析 及同 源性比 较随机挑 取 2个 p GE M― C h e n S

1 . 3阳性 重 组克 隆, 提取质粒 , 从正反两个方 向测序 , 分别读出

3 6

0 b p (

3 7 ~3

9 7 ) 和380bp(900~1

3 2

6 ) 的碱 基. 根据 测序结果合成 引物 HS

3 , 引物 HS

3 和HS

2 组 配以重组质粒 为模板 P C R扩增出约

1 0

0 0 b p 片段, 用EcoRI +C l a I ( 位于

9 0

9 b p处) 双酶 切后 获得 约600bp片段 , 重新 插入 p GE M-

7 z f (+) 的相应位 点.挑取阳性重 组 克隆 , 用同上 的方 法测 序, 两个 方 向分别 读出650bp和

5 8

0 b p . 综合两次测 序的结果, 读出汉坦病 毒 陈株 S基 因编码 区的全 序列 , ' 全长1290bp,编码

4 3 0个 氨基酸 .将所 测序列输 入计算 机与

7 6 ―

1 1 8株 S基 因做 同源性 比较.. 结果 二者 核苷酸 序列 同 源性 为86%, 推导 的氨基 酸序列同源性为

9 7%.抗 原性分析 显示, 二者 均有 5个抗 原表位 . 区 别在 于第 5个抗原位点 陈株 位于

2 9 7位为赖氨 酸( K) ,

7 6 ―

1 1 8株位 于280位为各 氨基( E) 测序及同源性 比较 结果见图1.23重组表达质 粒的鉴定 同批挑取