PDF《至堕巫 .》

第14卷第2 期1999年 6月中国病VI RoL0GI CA SI NI CA Vo l

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脊髓 灰质炎病 毒 缺陷 型 载体 瞬时表达系统 I的构 建.,.......至堕巫 王丽春 孙明姜莉董承 红王炯(中国医学 科学院中国协 和医科大学医学生物研究所,昆明650107)摘要为探 索 可表 达较 大 片段 外瓶基因的脊灰病 毒 重组 载体 . 以HB V ― S基因置换 脊灰病毒的P1基因 , 同时 另一途 径提 供 脊灰 病毒 P 1结 构蛋 白, 经 转染 八He l a细胞 中形 成映陷型重组病毒颗粒 , 此病 毒可感染新 的细 胞, 并表达其重 组 的外 源基因.但不产生 于代 病毒实验结果表明, 这种 瞬时 表达 系统 的构 建,为脊灰 病毒缺 陷 型重 组载 体 用于 基 因转导 技术 打下基础 . 关 键词 脊 灰病 毒,映陷 型重 组体 , 外 源基 因 随着分子病毒学 技术 的发展 , 脊 髓灰 质 炎病毒 ( 以下 简 称脊灰病 毒或Pv) 作 为一 种重 组病毒载体表达外源基因的研 究已日益 受到重视0J,在可表达小片段 外源基因的第一代脊灰活病毒重组载体研 究基础上 j , 一种可 表达 较大 片段外 源基 因(>

2 .

0 k b ) 的脊灰病 毒缺 陷型 重组载体在理论 和技术上 都得 到了发展 l

3 J , 该系统 的基本 思路是病 毒 结构 蛋 白和 病 毒复制 酶 系统的分离 J , 尽管其构建技 术略嫌复杂, 但 其具有 的优势 表现在 : 可表达较 大 片段 的外源 基因,不产生可繁殖 的子 代病毒 ;

具有 良好的生物安全性 ;

同时, 由于其表达 的 目的基 因产 物产生 在细胞 内, 故可诱 导机 体产生完 整的免疫 反应.基于这样 的基础 , 探索 有效 的脊灰病毒 皱陷型 重组载体 系统, 已成为病毒基 因技术 领域中的一个 重要研 究方 向.本 文介 绍的就 是 构建这 种 重组载体 系统 中的一个类 型―― 瞬时表达 系统 的研 究工作.

1 材料与方 法11质粒口XPA含有 S V

4 0启动 子序 列及 脊灰 病毒 I型Ma h o n e y抹基因全 e D NA 序列 ( 本实验室保存),pHB V 舍有HBV拿基 因序列 ( 中国NC株 , 本 实验 室保 存),均生长 于含 氨苄 青霉 素75~g/tntI.B中 .

3 7℃ 过夜 生长 , 碱 裂解 法 提取 DNA , ~ l p h a r o s e -

2 B柱 纯化 .一2 0℃ 冻存 备用

1 2 细胞与病 毒He l a细胞 生长于DME M-

5 % 小牛 血清(本所产品) 培养基中.37℃

5 %c , 生长成单层备用 , 病毒Ma . h

0 n e 抹感 染He

1 a单层细 胞(tnoi1),37℃ ,

7 h后 收获 细胞 , 冻 融破 碎细 胞.一2 0℃保 存备 用 收犒 日期 :

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9 8―0 4一1

0 . 修回日期 :

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9 8―0 9―2

1 阿家 自然科 学基 盘39670040云南省 面上 基盘

9 6 Ct

1 6 M 资助 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 2期 李琦涵 等:脊髓 灰质 炎病 毒缺 陷型 载体瞬 时 表达 系统 r的 掏建

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3 重组质粒 的构建 按 常规 克隆 方法… , 分 别掏 建含 有 脊灰病 毒壳蛋白VP I表达 载体 和 古有 HB V ― s基及脊灰病 毒 复制 醇 系统 基团的表达载体,即pro - P 1和pXD-HBS,用 于前者构建使用的PCR引物为:5AGTC AA( ~ T― T A T( ~- G TGC T C AG GT '

T TC A -

3 和5AGT AA GC T T A'

I 、 A TG TGG TC A GATC C TT G -

3 用于后者使用的引物为:5~CCTGA C GT C AT G GGA GG TTG G一3和5'

-GA GC T CG G GTC A AATG T AT AC C C

3 o X P A 为模 扳,PCR扩 增取 得P1的全 片段 . 两端带Hi n d Ⅲ位点, 插八pRcCMV 中;