PDF《至堕巫 .》

同时 . 以pHB V 为模 板.'

R扩 增取 搿争HBV. p r e S . S片段 , 两端分别 带有 A a t l I 丰¨S n a BI 位.利用pXPA质 粒中Pv基团上 第11l7位的 A a t Ⅱ位干¨第2953位 的SnaBI位,酶切去 昧之 问的 P V部 分结 柑蛋白, 将PCR取 得的HBV~ p r e S ― S基因 片段置 换人设位置,详细过 程见图1.虽 终 掏建 完成的 质粒 C s C l 离 心纯化 . 测 序确 证,

2 0℃ 冻存 备用//,―、 、 \ . P v D N A P , p X P A 、 P C R i

1 0 .

3 k b / l \ / l P

1 f g { Hi n d I Di g e s t Hi n d I Di g e s t PI g e n e f A a tI Di ge s t /T l '

\ p a r t 0f P

1 .

7 k b H 8V ― S r P r e S f s A n a a t B R j D . / 图l用于构 建脊 灰病 毒岛 I } 陷重组 系统 的质粒梅 建过 程a病毒锖 构蛋 白表达 载体 ( p RC ~ PI ) 的拘 建;

b病毒 复制酶 系统与H B V, p r e S . s基因 重组表 进载 体( p x r ) - H B S ) 的柯 建Fi g

1 Fh e Co n s t r u c t i o n

0 f r e c o m b i n a nt p ] a ~ i d s o f p ol i ov i r u s d e f e c t i v e v e c t o r s y s t e m a Th e C o n s t r u c t i o n o f e x p ~s s i o n p l a s mi d o f P V c a p s l d p r o t e ~ a( p RC ~P I ) ;

b Th e C o n s t r u c t i o a e x p r e s s i o n p l a ~ i d o f P V r e p l l c ~e a n d HB V r p r e S ― S g e n e( p XD H Bs )

1 4 质粒 对细 胞的 转染 及 重组 病毒 的标 记使』

1 j L i p o f e c t i n传染 疗法 , 取Lipofectin(Bio.Ra d )5

0 I , , 加入甲硫 氨酸 缺陷. D MEM 培养被100L,室温静置40mi n . 同时 , 纯化的pRc . P 1和pXD-HB S各4g加入 同样培 葬渡100p L , 二者 混 合后 , 再置章温

2 5r ai n . 混合 渣 转入 已经 同样 培 养液 洗过的Hela单 层细胞(75%) , 再加 入相 同 培养 漓08m1 .

3 7℃培养16h(5%帅+ 维普资讯 http://www.cqvip.com

1 1

8 中国病毒学第14卷 ( ) ) , 移 出上 清,加A甲硫 氨酸缺陷一 DMEM一2%胎 牛血清(Gi b . . )2 mL , 同时加A s甲硫 氨酸标记(40Ci/mL ) ,

3 7℃ . 分 别培 养

24、

48、72h,除去上清后, 用橡皮刮取出细胞,悬于RS B(

1 0 t n mo i / [ Tr i s ・ HC I p H

7 5 ,

1 5mmo l / LMg C i z ) 一NP一40(1%) , 4℃

2 h . 并趣 声 处理 . 离心去除 细胞 棱后 . 一2 0℃ 保存 备用.1.5共转染 后 缺陷 型病 毒颗 粒形 成 分析 制备l5%~3

0 %蔗糖梯度 离 心管 ( 蔗 糖溶 于RS B -

0 1 % NP .

4 0 ) 将共 转染 后 的细 胞样 品置 于蔗 糖顶端 .

3 8

0 0

0 r / r ai n ( S W4 0转头)4℃离心25h,分离 取样 . 每一样品量

3 0

0 L , 从 中取 出15L. 液 闪仪 ( B e e k ma n ) 测定其cpm值,绘制曲线, 取160S峰样品透析 . 4℃备用.1.6We s t e r r t 免痤印迹 分析 转 染细 胞样 品或 缺 陷病 毒感 染 细胞 样品. 上样于12%SDS-PAGE胶 电泳 , 并电转移至硝 酸纤 维膜上.此膜经TBST(

1 0mr a o i / LTr i s ・ 口pH8

0 ,

1 5 0mmo l / L Na C [ ,0

0 5 % T we e n -

2 0 ) 一1%B S A于 室温 封闭30mi n . 再 加抗 脊 灰病 毒 I型抗 体 或抗 H BS抗 体于 无BSA的TBS中,

3 7℃ 结合30mi n , T B S T 洗三次,加凡酶标二抗.37℃

3 0 n同法溉 三次,5一溴一

4 一氯一3一吲哚磷 酸/ 氯兰四唑 ( B C I P / N B T) 对 膜显 影.17免疫沉 淀160S峰值 样 品加 于RI P A― B S A (

0 5r ag / m1 . 内含

1 0m mo i / L I r i sHC

1 p H

7 .

5 ,1

5 0mm o l / I , Na C I ,

1 %去 载胆酸 ,

1 % T r l t o n X

1 0

0 ,

0 1 % S D S) 和抗脊灰 病毒 I型 抗体 (

1 :

1 0 0稀释),37℃孵育1h后, 抗 原一 抗体复合 物由 十倍体 积的金葡菌(10%) 于0℃ 吸附1h,l2500r/mi n , 离心15s.沉 淀以5%蔗 糖一1 % NP