PDF《Maestro 2 操作手册》

四、光谱分离 1.选择 Spectra 界面 2.如果 Cube 已打开, 图像会显示在视野内. 如果没有, 点击 Load Cube 工具栏或 File>

Load Cube,选择保存数据文件的文件夹,一般在 D:\Maestro Data\test-data 下各自名字的文件夹, 打开扩展名为 im3 的Cube 文件(*.im3) . 3.本教程适用的示例数据文件为 D:\Maestro Data\Images\Sample Data\QDot mouse with control.im3. 4.在 Spectra 界面下方点击 Real Component Analysis(RCA)键.注:RCA 用于自动检测和分离组成多维数据集(cube)的信号. 5.在弹出的 RCA 窗口内点击 Sample Spectrum 键,用鼠标指针在成像 物体上只包含自发荧光的区域按住鼠标左键并拖动画线条取样. 6.点击 Find Component Images 按钮,Maestro 自动识别并显示自发荧 光和其它荧光信号 7.选择想要拆分的信号: a. 左上角显示为自发荧光图像,点击图像两次选择其为自发荧光 图像,图像上方会显示为 Background ,颜色设置成白色或灰 色b. 单击其它认为是荧光信号的图像,其上方显示为 Signal_ ,下 拉菜单为其设置颜色. 8.点击 Find Spectra 按钮,会在在光谱分布图上会显示自发荧光和荧 光信号的荧光波谱图. 9.在下方列表中为每个光谱命名;

10.完成后点击 Transfer to Library Unmix and Close 按钮,将光谱拆 分条件加入光谱库并对 cube 进行拆分(如已 load 光谱分离文件,你 可能会被询问是否要覆盖原有光谱)注:对于弱信号可能数据有太多基线偏移, 若得不到想要的结果(如:完全拆分后的图像) ,重复 RCA 步骤并选择 Fit Offset 项,再次拆 分看结果是否改善.

五、图像调整及保存 1.光谱分离后系统新生成三张图片,其中两张灰阶图片位于窗口左下 方,另外一张伪彩图片位于右上方.注:灰阶图片可用于定量分析. 2.选择右上的伪彩图片,点击上方 Display Control 工具栏按钮,弹 出新的窗口,在此窗口进行图像调整. 3.调整步骤及保存图片 a 首先新窗口的左下区域显示目前图片所有的图层,一般上面是荧 光信号,下面是自发荧光,在Adjust 列中对某一图层进行勾选,可以 实现单独对相应图层进行调整.一般以勾选荧光信号图层为例;

b 在新窗口右下区域 Layer Blending Style 选择Overlay (Thresholded) ,图像颜色发生改变,红色区域代表信号比较强,蓝 色区域代表信号较弱;

c 在新窗口左上区域 Scaling 中勾选 Custom,下面 Min Clip 和Max Clip 数值变为可调整,通过改变数值的大小对图片进行调整;

d 重叠明场图片.在新窗口的左下面点击 Import Image 按钮, 选择此 Cube 文件对应的明场图片, 可以看到图片新增加了一个图层, 这时把自发荧光图层 Visible 列眼睛图标点击去掉,得到荧光信号和 明场图片叠加的图片;

e 选择调整满意的图片,通过 File>

Save Image>

Save (As Displayed) 保存到相应位置,建议保存为 Tiff 图片格式.

六、定量操作 1. 灰阶图片可以进行定量操作;

2. 光谱分离后系统新生成两张 Component 图片,其中一张是荧光信 号的,另外一张为自发荧光的,以荧光信号图片的定量操作为例;

3. 点击选择 Measure 界面,鼠标左键选择荧光信号灰阶图片;

4. 系统提供两种圈选感兴趣区域的方式,一种为通过阈值设定自动 识别,一种是手动圈选方形、圆形和不规则形状区域;

a 如果自动选择, 点击 Measure 界面内 Auto Calculate Threshold 按钮,通过调整 Threshold Level 来最终确定选区大小;