PDF《中国实验动物学会》

3 常用的缓冲液 3.1 0.01M 磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution.PBS) 先配成 A 液和 B 液, 其中 A: 0.2M Na H2PO4 贮存液 (PH7.6) : 15.60g 磷酸二氢钠 (NaH2PO4 q2H2O)溶解于少量水,加蒸馏水定容至 500ml,放于 4℃冰箱保存.B:0.2M Na2HPO4 贮存 液(HP7.6):将35.82g 磷酸氢二钠(Na2HPO4q12H2O)溶解并定容至 500ml,贮存于 4℃冰箱 备用.用时取 A 液13ml,B 液87ml,用1N 氢氧化钠或盐酸调 pH 至7.6,加蒸馏水至 2000ml. 3.2 0.05M Tris-HCL 缓冲液(PH7.6) 取三羟甲基氨基甲烷(Tris)6.57g, 加入少许的蒸馏水搅拌, 直至溶解, 再加入 1N 盐酸溶液 42ml, 定容至 100ml,于4℃冰箱保存.临用时,将上述溶液

10 稀释倍,即为 0.05M 缓冲液. 3.3 柠檬酸抗原修复液:称取柠檬酸 2.1g,加水至 1000mL,用1N 盐酸调 pH 至6.0.

5 3.4 显色液组成:称取 DAB 6mg 溶于

10 mL 0.05M Tris 缓冲液(pH7.6)中,然后加入 0.1mL 0.3% 过氧化氢,此液需要现配现用.

4 免疫组织化学方法(间接法) 4.1 切片经二甲苯 5min*

2、无水乙醇 5min*

2、95%乙醇 5min*

2、85%乙醇 5min、70%乙醇 5min 完成脱蜡.脱蜡后自来水洗 5min. 4.2 0.3%H2O2 甲醇处理切片

20 分钟. 4.3 水洗. 4.4 抗原修复. 4.5 PBS 洗3次,2 分钟/次. 4,6 加入血清于湿盒中孵育

20 分钟. 4.7 倾去血清,加入一抗于湿盒中孵育

60 分钟. 4.8 PBS 洗3次,2 分钟/次. 4.9 加入二抗于湿盒中孵育

30 分钟. 4.10 PBS 洗3次,2 分钟/次. 4.11 用含 0.5%DAB,0.02%H2O2 显色液孵育切片 5-10 分钟. 4.12 PBS 洗,水洗. 4.13 Mayer'

s 苏木素染核

1 分钟. 4.14 水洗

1 分钟,蓝化

10 分钟 4.15 切片再经 70%乙醇 、80%乙醇、90%乙醇各 1min,经95%乙醇 1min*

2、无水乙醇 2min*2 快速脱水后用二甲苯透明 5min,重复一次. 4.16 根据盖玻片规格和载玻片上组织多少,滴加适量中性树胶,封片.

6 4.17 以PBS 代替一抗为阴性对照.

5 有关说明和注意事项 5.1 为达到免疫组织化学技术的要求,组织固定越新鲜越好.离体的组织不及时固定,组织就 会自溶,抗原就会扩散,因此对于离体的组织尽量快的进行固定,有条件的应将其剖开,早取 材,早固定. 5.2 组织脱水必须彻底干净,组织块取材不能太大过厚,才能较好地完成脱水的过程. 5.3 切片必须完整、均匀、平展、无邹折,才有利在染色时的冲洗,有利于切片的牢固附贴. 5.4 切片必须烘烤附贴牢固,既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片,又不至于破 坏抗原. 5.5 切片脱蜡必须干净,否则将会影响免疫组化染色的最后结果. 5.6 必须彻底抑制内源性过氧化物酶的活性,才能降低背景的染色. 5.7 选择合适的抗体以及对其作适当的保存和稀释才能取得较佳的实验效果,一般与二抗相同 动物来源的非免血清进行封闭. 5.8 一抗与 HRP 的间的连接过程有多种途径,各种方法有各自的复合物,ABC 法,复合物是卵 白素和生物素结合的复合物,再带有 HRP,SP 法,(LsAB 法)的复合物是链雪菌素蛋白复合 物,再带有 HRP,EV 二步法的复合物则是二抗和三抗连接在一起的复合物,再带上 HRP.视 情况需在实验步骤中增加内源性生物素阻断步骤. 5.9 PBS 的冲洗也是非常重要的步骤, 对实验结果有重要影响, BS 冲洗的正确与否,也是导致最 后结果显示是否正常的关键.

6 抗原修复 6.1 微波抗原修复法:0.01M 柠檬酸盐缓冲液(PH6.0),于微波炉内微波辐射

10 分钟,待修复