PDF《ELISA 的种类及原理》

8 抑制 ELISA 为例简单阐述原理. 直接竞争抑制 ELISA 直接竞争抑制 ELISA 中, 预先将抗原包被在固相 载体上,并加入酶标的特异性抗体.实验时,加入待检抗原(或抗体) ,如果 待检对象是抗原, 则待检抗原就与预先包被在固相载体上的抗原竞争结构酶标 抗体;

如果待检测对象是抗体, 则待检抗体就与系统中原有的酶标抗体竞争结 合包被在固相载体上的抗原. 洗涤过程就可以洗掉被竞争下的酶标抗体, 最后 加底物显色.最终显色的结果与待检原(或抗体)量成反比.直接竞争抑制 ELISA 的原理如图 5.注意在直接竞争抑制 ELISA 中,同一预制备的体系既 可以测定抗原,也可以测定抗体. 图5直接竞争抑制 ELISA 原理 如同间接 ELISA 一样,直接竞争抑制 ELISA 也有两步信号放大的过程, 因此其灵敏度也比较高, 但是预先包被好固相载体并加入酶标抗体后, 实验时 本手册由中国免疫学实验网( www.immuexp.com )转自 Proteintech Group.

9 只需要将待检抗原或抗体稀释后加到体系中进行反应即可, 大大简化了 ELISA 的操作过程. 间接竞争抑制 ELISA 间接竞争抑制 ELISA 可以看作是用待检抗原或待 检抗体干扰一个预先制备的间接 ELISA 系统.其具体原理是:将抗原包被于 固相载体上, 依次加入特异性的抗体以及此抗体对应的酶标二抗作为预制备的 体系.实验时,加入稀释好的待检抗原(或抗体) ,待检标本中的抗原(或抗 体)就和预制备体系中固相载体上结合的抗原(或抗体)竞争结合特异性的抗 体(或固相载体上结合的抗原) .间接竞争抑制 ELISA 的原理如图 6. 图6间接竞争抑制 ELISA 原理 同间接 ELISA 一样,间接竞争抑制 ELISA 也有三步信号放大的过程,所 本手册由中国免疫学实验网( www.immuexp.com )转自 Proteintech Group.

10 以其灵敏度也比直接竞争抑制 ELISA 高. 从上述原理可以看出,竞争抑制 ELISA 对试剂的要求非常少,不管是单 抗还是多抗都可以用于实验,更重要的是不管被检对象是大分子物质还是多 肽、小分子药物、小分子激素等只有一个表位的分子不能使用夹心 ELISA 的 都可以使用竞争抑制 ELISA 检测.另外,像乙肝标志物检测中,e 抗原很不稳 定,容易降解变为核心抗原,因此在检测 e 抗体时不能用夹心 ELISA 检测而 只能选用竞争抑制 ELISA. 除以上介绍的几种基本的 ELISA 外,人们还可以根据自己的实际需要灵 活设计其它类型的 ELISA, 例如可以引入生物素-亲和素提高系统的放大倍数, 再如引入非酶标二抗或者 Protein A、Protein G 等增加固相载体的载量或者增 加系统的特异性等. ELISA 实验的操作 不管是哪一种 ELISA,它的操作都由以下几种基本的操作组合而成: (1) 将抗原或抗体吸附到固相载体上;

(2) 封闭;

(3) 加入待检样品以及后续试剂;

(4)温育;

(5)洗涤去掉游离未结合的反应物;

(6)加入酶检测底物;

(7) 结果的判读. 这里针对每一个单独步骤进行讲解, 请读者根据实验原理部分的 讲解体会操作过程. 将抗原或抗体吸附到固相载体上 这一步又叫包被,是ELISA 操作中非常关键的一步,包被的好坏直接影 响到 ELISA 的灵敏度和特异性.包被过程至少应该考虑以下影响因素: 固相载体的选择 固相载体有多种多样的形式, 它可以是微孔板、 小试管、 微珠或者膜, 其中

96 孔板是应用最广泛的形式. 固相载体的材料也有很多种, 常见的材料有聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、纤维素等,它们都能非 特异性吸附蛋白质, 这种吸附是基于抗原疏水特性而发生的物理性吸附, 并未 发生化学变化, 所以抗原被吸附到固相载体上后仍然保持其免疫学活性.聚苯 乙烯因其价格低廉、对蛋白的吸附能力强,所以应用最广泛.需要注意的是, 所有酶标板因厂商生产工艺的差别, 不同厂商或同一厂商不同批次之间的酶标 本手册由中国免疫学实验网( www.immuexp.com )转自 Proteintech Group.