PDF《ELISA 的种类及原理》

11 板对蛋白吸附能力都不同, 所以每次更换新的酶标板前都应该设计预实验确定 酶标板的均一性是否良好. 包被的温度与时间 前面讲过,包被是根据抗原或抗体与固相载体间的 疏水作用而发生吸附的,一般来讲,温度越高,蛋白质的疏水作用就越明显, 因此对于蛋白质抗原或抗体来说适当提高温度有利于包被的进行, 但是温度过 高会影响抗原或抗体的结构. 一般包被都在 37℃进行 1-3 小时, 如果包被的温 度较低,则需要延长包被时间,例如 4℃包被一般都需要过夜.包被的时间不 能太短,否则包被不能充分进行. 包被缓冲液 包被缓冲液一个主要作用就是提高抗原或抗体的疏水性但 不至于破坏其免疫活性.理论上讲,对于蛋白质类抗原或抗体的最佳包被 pH 应该比其 PI 高1-2 个单位,这是因为在 PI 以及更低的 pH 条件下,蛋白质总 是倾向于将亲水基团暴露在外而将疏水基团包裹在内部, 而偏碱性的条件有利 于其疏水基团的暴露,从而增强其与固相载体的结合.然而实际操作中,每种 蛋白质的 PI 都是很难确定的,所以包被缓冲液首选公认比较好用的缓冲液, 如50mM pH 9.6 的碳酸盐缓冲液.另外也可以尝试 20mM Tris-HCl,pH 8.5, 还可以尝试 10mM PBS,pH 7.2.有时候提高缓冲液的离子浓度也可以提高抗 原或抗体的疏水性, 此时可以尝试向缓冲液中加入 0.6M 左右的 NaCl.有些小 分子物质比较难以包被, 可以采取特殊的方法包被, 例如对于脂类分子的包被, 可先将其溶解于酒精中, 然后加至酶标板孔, 最后自然条件下放置使酒精挥发 充分从而最终只留下脂类分子.对于某些小分子多肽也可以采用类似的方法, 如采用低浓度的 Tirs-HCl 将多肽稀释好, 加到酶标板孔内, 自然放置晾干也可 以达到比较好的包被效果. 最佳包被量 最佳包被量是需要通过实验来确定的,最常用的办法是棋 盘滴定法,即做多个平行实验,采用不同浓度的抗原或抗体包被,另外再对系 统里其它的试剂也做不等浓度的平行实验, 最终根据反应的灵敏度和信噪比确 定最佳包被量.对于初学 ELISA 的实验者或者不是很严格的实验来说,一般 按1-10ug/ml,每孔 50-100ul 左右的蛋白类抗原或抗体包被比较合理,然后再 在此基础上进行向上或向下调节. 本手册由中国免疫学实验网( www.immuexp.com )转自 Proteintech Group.

12 封闭 抗原或抗体包被完成后,固相载体表面依然存在未被占用的位点,这些 位点还可以继续结合抗原或抗体,为了排除这些位点对 ELISA 后继步骤的干 扰,就需要引入一些无关的物质将这些位点占用,这个过程就是封闭.最常用 的........