PDF《产品中文说明书》

2、饱和湿度的培养箱中培养. 13. 复苏后的第二天,给复苏的细胞换用新鲜的人脐带间质干细胞完全培养基(已预 热到37℃). 14. 之后,每两天给细胞换新鲜的完全培养基直到细胞达80%的汇合度. 15. 当细胞达80%-90%的汇合度,可进行消化和传代. 注意:为避免反复温热培养基,如果在一次操作中无法用完整瓶培养基,建议分装到 适当的无菌容器中.换液时只取当天所需培养基量进行预热. 图1已贴壁的人脐带间质干细胞 CBPI0349A8 HUXUC-01001 Page

4 of

7 OriCell 人脐带间质干细胞的传代 所需试剂 ? 0.25%Trypsin-0.04%EDTA(货号:TEDTA-10001) ? Phosphate-BufferedSaline (1*PBS) (货号:PBS-10001) ? OriCell 人脐带间质干细胞完全培养基(货号:HUXUC-90011) 传代 1. 将人脐带间质干细胞完全培养基、1*PBS、0.25%Trysin-0.04%EDTA预热至37℃. 2. 吸去培养液. 3. 用1*PBS(T25培养瓶加入约3 mL,T75培养瓶加入约6 mL)洗涤细胞2-3次.注 意不要损害贴壁的细胞. 4. 吸去1*PBS. 5. 加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA(T25加入约1 mL,T75加入约2-3 mL).轻轻旋 转,使0.25%Trypsin-0.04%EDTA覆盖细胞表面,消化,显微镜下观察到约70%- 80%左右的细胞变圆后,用手轻拍培养器皿的壁使细胞脱壁. 注意:由于不同实验室所使用的Trysin效价不同,消化时间可能会略有不同,具体时间 应以显微镜下观察到的情况为准. 6. 当看到明显的细胞脱落下来,立即加入预热的完全培养基(T25培养瓶加入约3 mL3 mL,T75培养瓶加入约3 mL6 mL)终止消化. 7. 用吸管吸取液体,反复吹打培养器皿底壁,使细胞彻底脱离器皿底壁.吹打时动 作不宜太猛,尽量避免产生气泡. 8. 将细胞悬液转移到15 mL的离心管中. 9.

250 g,离心5min. 10. 小心弃去上清液. 11. 加入2 mL完全培养基重悬细胞.吹打时动作不宜太猛,尽量避免产生气泡. 12. 对细胞进行台盼蓝染色计数活细胞数量. 13. 按照2.5-4.0*104 个活细胞/cm2 的密度来接种细胞. 14. 加入适量的人脐带间质干细胞完全培养基,轻轻摇晃细胞培养器皿,使细胞均匀 分布. 15. 把细胞放入37℃、5%CO

2、饱和湿度的培养箱中培养. 提示 CBPI0349A8 HUXUC-01001 Page

5 of

7 1. 换液时机 传代后发现有很多死细胞,应该予以换液. 当人脐带间质干细胞的完全培养基pH值变酸时(培养液的颜色变黄),而且此 时细胞仍未可以传代,则应该予以换液.一般来说,人脐带间质干细胞的换液间隔为 2-3天. 2. 传代时机 当人脐带间质干细胞达到80%-90%汇合时,就应该进行传代.不可让人脐带间质 干细胞完全融合或过度融合,否则会发生生长接触抑制.这将严重影响细胞的生长状 态. P7-40* P7-100* 图2 人脐带间质干细胞(P7) 3. 细胞汇合度提示(以C57 BL/6MSC为例) 图3 细胞约70%-75%汇合 图4 细胞约85%-90%汇合 CBPI0349A8 HUXUC-01001 Page

6 of

7 OriCell 人脐带间质干细胞的冻存 所需试剂 ? OriCell无蛋白非程序冻存液(货号:GUXMX-07021) 冻存 注意:冻存前24小时需要给细胞换上新鲜的完全培养基. 1. 待细胞生长至可传代的密度,即可消化准备冻存. 2. 细胞的消化请参考OriCell 人脐带间质干细胞的传代操作中1-8步骤. 3. 对细胞进行计数. 4. 消化后的细胞悬液经250 g离心5 min. 5. 小心弃去上清. 6. 用OriCell间质干细胞无蛋白非程序冻存液重悬细胞,并使细胞的密度为1*106 个活 细胞/mL(或希望达到的细胞密度). 注意:OriCell无蛋白非程序冻存液在使用前需保持4℃. 7. 把细胞分装到冻存管(需提前做好标记或贴上标签)中,旋紧冻存管盖. 8. 将封好的冻存管直接放进-80℃冰箱.24 h后将细胞转移至液氮进行长期保存. 注意:如使用程序冻存液,需将封好的冻存管放入程序降温盒后方可放入-80℃冰箱.. 参考文献 Hwai-Shi Wang, Shih-Chieh Hung, and Shu-Ting Peng. (2004) Mesenchymal Stem Cells in the Wharton's Jelly of the Human Umbilical Cord. Stem Cells 22: 1330-1337. Rahul Sarugaser, David Lickorish, and Dolores Baksh. (2005) Human Umbilical Cord Perivascular (HUCPV) Cells: A Source of Mesenchymal Progenitors. Stem Cells 23: 220-229. SercinKarahuseyinoglu, OzgurCinar, and EmineKilic. (2007) Biology of Stem Cells in Human Umbilical Cord Stroma: In Situ and In Vitro Surveys. Stem Cells 25: 319-331. CBPI0349A8 HUXUC-01001 Page