PDF《958年创刊 2》

p A c G F P 1- N 1载体, 为东北林业大学生命科学学 院动物发育研究室自存.

1 .

3 绵羊 O c t 4基因启动子的克隆 此前, 笔者根据 G e n B a n k中已发表的人、 鼠、 兔、 牛Oct4启动子中的保守序列设计了 1对引物 S P O c t

4 -

1 、 S P O c t 4-

2 , 对绵羊 O c t 4基因进行了 P C R扩增, 并获得了长度为

12 0 6b p的产物( 结果图未显示) , 并构建了克隆载体 p M D

1 8- T-S P O c t

4 , 其引物序列 如下: S P O c t 4-

15 ′ -C A T A T G A A G G G T T G A G C A C T T G T T T-3 ′ , S P O c t 4-25 ′ -G G A T C C C A C T A G C C T T G A C C T C T G G-

3 ′ .

1 .

4 绵羊 O c t 4启动子真核表达载体的构建 设计引物时, 在引物上游分别引入了酶切位点 N d eⅠ和BamHⅠ. 利用 N d eⅠ和BamHⅠ对 p M D

1 8-T-S P O c t

4 质粒进行大量酶切, 获得绵羊 O c t 4启动子的目的基 因, 并命名为 S P O c t 4-N B ;

p A c G F P 1-N 1载体自身 存在 N d e Ⅰ和BamHⅠ这两个酶切位点, 因此同样利 用NdeⅠ和 B a m HⅠ对pAcGFP1- N 1载体进行大量 酶切, 回收大片段, 并命名为 p A c G F P 1- N 1- N B . 将上述获得的 S P O c t 4-N B基因片段与 p A c G F P 1- N 1- N B进行连接, 连接体系为绵羊 O c t 4启动 子目的基因产物

7 . 5μ L , 线性 p A c G F P 1-N 1载体 1μ L ,

1 0* B u f f e r 1μ L , T 4连接酶

0 . 5μ L , 4℃连接过 夜;

随后对该连接产物进行转化, 挑取单克隆扩大培 养, 并采用质粒小提试剂盒提取质粒.对获得的重组 质粒进行 P C R鉴定, 并采用 B a m H Ⅰ和BglⅡ进行 双酶切鉴定, 测序正确后将重组质粒命名为 S P O c t

4 - p A c G F P 1- N

1 .

1 .

5 胚胎成纤维细胞的培养

1 .

5 .

1 小鼠胚胎成纤维细胞的培养 挑选性成熟的 雄性和雌性 I C R小鼠, 晚上进行合笼, 第 2天早上见 栓, 见栓

1 3 . 5d后取胚胎进行小鼠胚胎成纤维细胞 ( M E F ) 原代培养, 当原代细胞达到

9 0 %左右汇合度 时, 使用

0 .

0 5 %的胰酶对其进行消化和传代培养.

1 .

5 .

2 绵羊胚胎成纤维细胞的培养 取龄胎1

2 0天 左右绵羊胎儿的耳尖组织, 使用常规方法进行绵羊胚 胎成纤维细胞( S E F ) 的原代和传代培养.

1 .

6 小鼠 E S 细胞的培养 选择第 2代或第 3代的 M E F作为饲养层细胞, 调整 M E F细胞密度, 使其在 E S细胞接种前

2 4小时 汇合度达到

9 0 %, 向MEF培养基中加入丝裂霉素 C , 使其终浓度为

1 0μ g / m L , 作用 3h后用 P B S清洗 3次, 然后使用

0 .

0 5 %的胰酶消化, 计数后, 接种在

0 .

1 %明胶包被的培养皿上.E S细胞复苏后将其接 种在饲养层上.

1 .

7 小鼠原核期胚胎的获得 选择性成 熟的雌性ICR小 鼠进行超数排卵,

1 7 :

0 0点左右注射

1 0I U的PMSG,48小时后注射

1 0I Uh C G , 然后将其与雄性小鼠进行合笼.第 2天 早上见栓, 取见栓

0 . 5d的母鼠, 颈椎脱臼法处死后 取卵巢和输卵管, 并使用注射器冲出输卵管内的胚 胎, 显微镜下收集形态正常的原核期胚胎, 随后将胚 胎转移到培养滴中,

3 7℃培养, 备用.

1 .

8 细胞的转染和胚胎的转染 细胞的转染: 采用阳离子脂质体法转染细胞, 利 用脂质体转染试剂分别对 M E F 、 S E F 、 E S细胞转染 S P O c t 4- p A c G F P 1-N 1质粒和 p A c G F P 1-N 1质粒, 其中 p A c G F P 1- N 1质粒为阳性对照.转染前