PDF《958年创刊 2》

1 2小 时更换无抗培养基, 并使细胞密度转染时达到

9 0 % ~

9 5 %汇合.分别使用

5 0μ LD M E M稀释

0 . 4μ g D N A 和2μ L脂质体试剂, 温和混匀, 室温放置 5m i n后将 稀释 的DNA和稀释的脂质体混合(总体积为100μ L ) , 室温放置

2 0m i n后加入到每孔中, 混匀后 在CO2培养箱

3 7℃孵育

1 2h , 更换合成培养基. 胚胎的转染: 用浓度为

1 . 5m o l / L的盐酸消化处 理, 去除原核期的小鼠胚胎的透明带, 将去除透明带 的胚胎转移至

1 0 0μ L的微滴中, 用50μ LD M E M分 别稀释

0 . 8~

1 . 0μ gS P O c t 4-p A c G F P 1-N 1质粒和 2μ L脂质体, 混匀后室温静置 5m i n ;

将两者混合混 匀, 室温静置

2 0m i n ;

在每滴中加入 5μ L的DNA- 脂质体 复合物, 轻轻晃动培养基,

3 7℃、

5 % C O

2 ・

2 ・ №.

1 0 ,

2 0

1 6 培养. 转染

2 4 ,

4 8 ,

7 2小时后, 在蓝光激发条件下, 于倒 置荧光显微镜下观察转染后细胞和胚胎荧光发生情 况.

2 结果

2 .

1 绵羊 O c t 4基因启动子的序列分析结果 利用 P r i m e r P r e m i e r

5 . 0软件对克隆获得的绵羊 O c t 4启动子分析的结果表明: 该克隆 O c t 4启动子

3 3 5位点有 1个CAATb o x , 但未发现 T A T Ab o x .另外, 该序列还在

12 1 1位点含有一个 G C _ S P 1序列或 S P 1序列以及一些其他功能区段.见表

1 . 表1绵羊 O c t 4启动子相关调控位点分析 T a b l e

1 A n a l y s i s o f r e l a t e dr e g u l a t o r ys i t e s i ns h e e p O c t - 4p r o mo t e r 序号 基序 碱基组成 数量/ 个 位点/ n t

1 -

3 5 T T G A N A

3 5

5 5 ,

8 6

0 ,

8 9

0 2 C A A T C C A A T

1 3

3 5

3 C A C T A T A A A

4 1

9 1 ,

11 5

5 ,

11 7

7 ,

11 9

9 4 G A G A A A T N N N A C

2 8

9 2 ,

9 3

8 5 G C _ S P

1 G G G C G G

1 12

1 1

6 R B S A G G A G G

1 2

2 5

7 S P

1 G G G C G G G

1 12

1 1

8 g l y c o A A Y N N N A C

1 6

9 0

2 .

2 绵羊 O c t 4基因启动子真核表达载体的构建 结果 重组表达载体 S P O c t 4-p A c G F P 1-N 1经PCR、酶切鉴定、 测序, 结果表明 S P O c t 4片段未发生突变. 使用限制性内切酶 N d e Ⅰ和BamHⅠ对 p M D

1 8- T- S P O c t 4重组质粒进行双酶切电泳后胶回收绵羊 O c t

4 启动子的目的基因小片段 S P O c t 4-N B , 同时, p A c G F P 1- N 1载体经 N d e Ⅰ和BamHⅠ酶切胶回收, 获得 大片段 p A c G F P 1-N 1-N B , 将两者连接获得重组质 粒SPOct4-p A c G F P 1-N

1 , 对其进行酶切和 P C R鉴定, 结果( 见图

1 ) 在约

12 0 0b p处观察到目的条带;

对重组质粒使用 B g l Ⅱ和BamHⅠ进行双酶切鉴定, 结果表明, 在约

6 0 0b p和45

0 0b p处观察到与预期 结果相一致的 2条条带.

2 .

3 绵羊 O c t 4基因启动子在细胞中的表达活性检 测结果

2 .

3 .

1 成纤维细胞中的表达活性 使用脂质体转染 法将 S P O c t 4-p A c G F P 1-N 1质粒和 p A c G F P 1-N

1 质粒( 阳性对照) 分别对小鼠成纤维细胞和绵羊成纤 维细胞进行共转染,

4 8小时后观察细胞绿色荧光蛋 白的表达情况, 结果表明: 在转染 p A c G F P 1- N 1质粒 的试验组小鼠胚胎成纤维细胞和绵羊胚胎成纤维细 胞均出现绿色荧光蛋白表达( 见291页彩图

2 A和2C);

而转染 S P O c t 4-p A c G F P 1-N 1质粒的试验组

1 . P C R鉴定结果;

M . M a r k e r Ⅲ;