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2000、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵、硝酸纤维素膜、鼠抗MBP-1单克隆抗体、兔抗β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG, DAB 显色试剂盒均购自晶美生物公司,其余试剂为国产或进口分析纯. 1.3 MBP-1基因的扩增 根据GenBank中MBP-1 基因序列(GenBank accession number:GU170215)设计一对PCR引物,上游引物序列为:5?-gcaagcttatggatg gaacagaaaataaatctaag-3?,下游引物为:5?-gcggatccttacttggccaaggggtttctgaag-3?,上下游引物分别引入HindⅢ和BamHⅠ限制性内切酶位点.引物由大连宝生物科技有限公司合成.以质粒pCMV6-XLM为模板建立扩增体系,循环参数为:先94 ℃预变性3 min, 然后进入循环,94 ℃ 变性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min,共30个循环,末次循环自动延伸7 min,扩增完毕后取10 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并对目的条带进行胶回收纯化. 1.4 重组质粒的构建 将MBP-1基因片段和质粒载体pcDNA3.1(+)经限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ双酶切后,在T4噬菌体DNA连接酶作用下进行链接反应,取5 μL链接液转化大肠杆菌JM109感受态细胞,取200 μL转化液铺于LB平板固体培养基(含氨苄青霉素50 μg/μL),

37 ℃孵育过夜,次日随机挑取阳性克隆接种2mL含50 μg/μL的LB液体培养基,37 ℃振摇培养16-18 h后提取质粒DNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测进行初步筛选,对重组质粒进行酶切和DNA测序鉴定. 1.5 细胞培养和转染 食管癌Eca109细胞以相同细胞数接种25cm2 细胞培养瓶,置CO2孵箱培养,当细胞达90%融合时用于转染,细胞分为三组,每组3瓶细胞,第一组转染重组质粒pcDNA3.1-mbp-1,第二组转染质粒pcDNA3.1(+),第三组不做任何处理,细胞转染按脂质体转染试剂Lipofectin2000操作说明书进行. 1.6 Western-blotting 检测 转染72 h后收集细胞,每瓶细胞加入1 mL蛋白裂解缓冲液,细胞裂解液置冰浴超声处理1 min,4 ℃以12000转/分离心10 min,收集上清液,采用Bradford法[2]测定各样本蛋白质含量,调节各样本的蛋白浓度使其相等.取蛋白样品各10 μL,加入等量2*SDS凝胶加样缓冲液,100 ℃煮沸3 min后上样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳完毕后用BR10592型半干转移系统将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上,膜用含50 g/L脱脂奶粉的TTBS封闭3 h后,依次与鼠抗MBP-1单克隆抗体、酶标二抗结合,最后用增强型DNA显色试剂盒显色,凝胶成像系统摄像,用β-actin作为内参照进行相同印迹实验,通过软件对蛋白印迹条带进行灰度值对比分析.

2 结果 2.1 重组质粒的鉴定 随机挑取转化后生长出的10个阳性菌落,接种LB液体培养基(含氨苄青霉素50 μg/μL),37 ℃振摇培养16 h后,用质粒提取试剂盒提取质粒,0.8%琼脂糖凝胶电泳结合紫外光灯观察发现2个分子量比载体质粒pcDNA3.1(+)大的质粒,对其中一个大分子量质粒用限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ双酶切1 h,0.8%琼脂糖凝胶电泳结合紫外光灯观察发现该大分子量质粒能够切下大小约为1kb的插入片段,其大小与MBP-1基因大小相符(图1),DNA测序表明插入片段的核苷酸序列与GenBank中MBP-1基因序列完全一致,表明重组质粒构建成功,并命名为pcDNA3.1-mbp-1. 2.2 MBP-1在食管癌细胞实现高表达 取重组质粒pcDNA3.1-mbp-1转染细胞裂解液、质粒pcDNA3.1(+)转染细胞裂解液和空白对照细胞裂解液各10 μL,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜,依次与一抗、二抗反应,最后显色,结果发现MBP-1分子在质粒pcDNA3.1(+)转染细胞和空白对照细胞表达量基本相同,MBP-1分子在重组质粒pcDNA3.1-mbp-1转染细胞表达量明显增高,其灰度值约为质粒pcDNA3.1(+)转染细胞的2.1倍,见图2. 图2 MBP-1分子的Western-blotting 检测结果