DOC《西北农林科技大学动物科技学院》

(2)Mark4对线粒体膜电位变化的影响;

(3)细胞色素C免疫荧光检测;

(4)线粒体功能关键基因的表达水平变化. 5.研究方法及技术路线 (1) 研究方法: 培养3T3-L1脂肪细胞,转染Mark4超表达载体和干扰载体,利用荧光显微镜观察观查细胞中线粒体形态,采用流式细胞仪检测细胞中线粒体膜电位变化,通过免疫荧光染色技术测定细胞色素C的荧光变化,采用定量PCR技术和蛋白杂交等检查线粒体功能相关基因的表达水平. (2) 技术路线: 6.预期结果 (1)阐明Mark4对线粒体功能的影响;

(2)探讨Mark4可能通过对线粒体的作用. 7.研究的创新点 本试验首次通过基因功能研究方法即超表达和干扰Mark4基因转染前体脂肪细胞系3T3-L1细胞,阐明Mark4对3T3-L1细胞中线粒体的形态学影响、线粒体发育的影响,并从信号通路对相关调控机理进行了探讨. 8.所需的主要仪器设备和试剂及工作条件 (1) 仪器设备:PCR扩增仪(Veriti

96 Well Thermal Cycle)、电子天平、常温高速离心机、低温冷冻离心机、移液器、高压灭菌锅、凝胶成像仪、超净工作台等. (2) 试剂:Trizol(TaKaRa公司);

质粒抽提试剂盒(Omega公司);

RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit、Taq DNA聚合酶(Fermentas公司);

DNA Marker(天根公司);

TurboFect? in vivo Transfection Reagent(Fermentas公司);

DMEM(高糖)干粉(Gibco公司);

HEPES、胰蛋白酶(Merck公司);

胎牛血清FBS(四季青公司);

引物(上海生工公司);

苹果酸脱氢酶1(MDH) 和细胞色素C (Cytc) 一抗(Bioword公司),二抗(武汉博士德公司);

MyHC一抗MF-20(美国DSHB公司),二抗羊抗鼠IGg2b(英骏公司)等. 9.论文工作进展安排 工作进展安排表 时间Time 工作进展安排Work arrangement 2014.11-2014.12 收集资料,撰写开题报告,学习相关实验技术 2014.12-2015.02 筛选Mark4干扰质粒载体,检测超表达及干扰效率 2015.02-2015.04 Mark4对线粒体功能相关指标的影响 2015.04-2014.05 整理试验数据,分析总结试验结果 2015.06 撰写本科学位论文,答辩 10.经费预算 经费预算表 用途 金额(元) 胎牛血清

500 DMEM(高糖)干粉

200 HEPES、胰蛋白酶

100 实时定量检测试剂

500 质粒提取试剂盒

100 测序费用

100 RNA提取试剂盒

100 反转录试剂盒

300 抗体

400 JC-1染液、DAPI染料

100 其它试剂

400 文印费

200 合计

3000 11研究工作中面临的技术难点和拟采取的解决办法 (1)学习动物生化中脂类代谢及其调控的基础理论知识;

(研读《生物化学》与《细胞生物学》等专业书籍,夯实基础知........