DOC《附件3：分离培养钩体方法》

附件3:分离培养钩体方法

1 培养基制备方法 1.

1 Korthof培养基成分和制备方法 1.1.1 成分 蛋白胨(可用胰蛋白胨代替) 400mg 氯化钠(NaCl) 700mg 氯化钾(KCl) 20mg 碳酸氢钠(NaHCO3) 10mg 磷酸二氢钾(KH2PO4) 120mg 碳酸氢二钠(12个结晶水)(N2HCO3 .12H2O) 440mg 氯化钙(CaCl2) 20mg(如高压灭菌或煮沸后出现沉淀,可省去此成分) 蒸馏水 500ml 1.1.2 制法 1.1.2.1将以上成分溶于蒸馏水中煮沸20min过滤,校正pH为7.2,分装于烧瓶内,每瓶100ml,15磅30min高压灭菌. 1.1.2.2 兔血清56℃30min灭活. 1.1.2.3 将1.1.2.1液以无菌操作加入灭活兔血清最后浓度为8~10%. 1.2 Tepck ии培养基(磷酸盐缓冲溶液)成分和制备方法 母液 1/15mol/L Na2HPO4.12H2O 12g/500ml蒸馏水 磷酸缓冲液 1/15mol/L KH2PO4 4.5g/500ml蒸馏水 取1/15mol/L Na2HPO4.12H2O 80ml、1/15mol/L KH2PO4 20ml,混匀,调整pH7.2~7.4,加入蒸馏水900ml混匀,分装试管,并用15磅30min高压灭菌,再以无菌操作加入灭活兔血清最后浓度为8~10%.

2 培养分离病原体 2.1 病人血液培养: 采集早期病人血液,无菌操作接种于2~3管Korthof培养管中,每管接种1~3滴.血培养管置28℃培养.每隔5~7d取培养物暗视野显微镜下观察有无钩端螺旋体生长,若有生长,即为分离阳性.若未见生长,需继续培养60d,仍不见钩端螺旋体方作阴性处理. 2.2病人尿液培养: 接取病后两周以上的病人中段尿30~50ml于无菌离心管中3500~4000r/min离心1h.取沉渣0.3~0.5ml接种于2~4管上述培养基中,28℃孵育.每隔5~7d取材镜检.为提高检出率和减少污染,可在采集尿标本的前一天晚上给病人服碳酸氢钠(NaHCO3)2~4g,同时,在培养基中加入100~400μg/ml 5-氟脲嘧啶或1/2000的磺胺嘧啶. 2.3 动物肾脏培养: 无菌操作,采集新鲜动物肾脏(包膜完整),剪取米粒大小接种于2~3管Korthof培养管中.置28℃培养.每隔5~7d取培养物暗视野显微镜下观察有无钩端螺旋体生长,若有生长,即为分离阳性.若未见生长,需继续培养60d,仍不见钩端螺旋体方作阴性处理. 3. 菌株分群、分型: 应用分群血清与新分离的钩端螺旋体作凝集试验,确定菌群.应用交叉凝集素吸收试验或分型因子血清来确定菌型.