PDF《牛病毒性腹泻病毒 HB-bd毒株 E2基因的 克隆表达及免疫原性...》

15 ′ -C G G A A T T C A T G G T G A A G G T G G-3 ′ ( 下画线部分为 E c o RⅠ 酶切位 点) , F

25 ′ -T G C C G G T C C T T A C A T G T A T T G T-

3 ′ ( 下 画线部分为 S a l Ⅰ酶切位点) .

2 方法

2 .

1 s E 2基因片段的 P C R扩增 以BVDV河北分离株 H B- b d毒株 E 2基因重组 质粒 p M D

1 8- E 2为模板, 用F1/F2引物进行 P C R扩增.P C R反应条件:9 4℃预变性 3m i n ;

9 4℃变性 1m i n ,

5 5℃退火

4 5s ,

7 2℃延伸

4 0s , 共30个循环;

7 2℃再延伸 8m i n .取5μ LP C R产物用

1 %琼脂糖 凝胶电泳检测.

2 .

2 s E 2基因克隆载体的构建及鉴定 将sE2基因的 P C R产物克隆入 p M D

1 8-T载体, 转化大肠杆菌 J M

1 0 9感受态细胞, 蓝白斑筛选阳 性克隆 p M D

1 8-s E

2 , 小提阳性质粒, 用限制性内切 酶EcoRⅠ、 E c o R Ⅰ/ S a l Ⅰ进行单/ 双酶切鉴定.

2 .

3 s E 2基因原核表达载体的构建及鉴定 分别对 p M D

1 8-s E 2和pET20b表达载体进行 E c o R Ⅰ/ S a l Ⅰ双酶切, 胶回收纯化 s E 2基因片段和 p E T

2 0 b 酶切产物.用T4D N A连接酶连接 s E 2基因 与pET20b片段, 连接体系:s E 2基因

1 0μ L ,p E T

2 0 b 表达载体

4 . 0μ L , T 4D N A连接酶

2 . 0μ L ,

1 0*T

4 D N A连接酶 B u f f e r

2 . 0μ L , 用ddH2O补至

2 0μ L ,

1 4℃连接过夜.用连接........