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1 尽可能避免水没过管帽,以减少污染的风险.

2 要快速完成细胞复苏过程,融化过程时间过长,会造成复苏后的细胞活性较 差. 5. 用70%-75%酒精消毒冻存管口的外壁. 6. 在超净台中打开冻存管,用吸管将细胞冻存悬液移入装有9 mL人脂肪干细胞无血 清完全培养基的15 mL离心管中.注意这一过程不要有气泡的产生. 7. 为了减少细胞损失,往冻存管中加入1 mL人脂肪干细胞无血清完全培养基,稍微 吹打,用吸管将这1 mL的细胞悬液吸入离心管中,再用吸管将离心管中的细胞轻 轻的吹打混匀. 8. 将细胞悬液经250 g(对应于Eppendorf 5810R离心机是1134 rpm)离心5 min. 9. 尽量去除上清液,向细胞沉淀物加入2~3 mL的人脂肪干细胞无血清完全培养基 (已预热到37℃),轻轻吹打均匀. 10. 将细胞按2.0-3.0*104 个活细胞/cm2 的密度接种到Corning CellBIND Surface的T25培 养瓶中;

11. 加入足量的人脂肪干细胞无血清完全培养基,轻轻摇晃细胞培养瓶使细胞均匀分 布. CBPI0481A2 HUXMD-90061 Page

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6 12. 在37℃、5%CO

2、饱和湿度的培养箱中培养. 13. 复苏后的第二天,给复苏的细胞换用新鲜的人脂肪干细胞无血清完全培养基 (已预热到37℃). 14. 之后,每两天给细胞换新鲜的完全培养基直到细胞达80%-90%的汇合度. 传代 1. 将人脂肪间质干细胞无血清培养基、1*PBS、TrypLE? Express预热至37℃. 2. 吸去培养液. 3. 用1*PBS(T25培养瓶加入约3 mL,T75培养瓶加入约6 mL)洗涤细胞1次.注意 不要损害贴壁的细胞. 4. 吸去1*PBS. 5. 加入TrypLE? Express (T25加入约1 mL,T75加入约2-3 mL).轻轻旋转,使TrypLE? Express覆盖培养器皿表面,消化,显微镜下观察到约70%~80%左右的 细胞变圆后,用手轻拍培养器皿的壁使细胞脱壁. 注意: 由于不同实验室所使用的消化液效价不同,消化时间可能会略有不同,具体时间应 以显微镜下观察到的情况为准. 6. 立即加入三倍体积的1*PBS稀释消化. 7. 用吸管吸取液体,轻轻地反复吹打培养器皿底壁,使细胞彻底脱离瓶皿底壁.吹 打时动作不宜太猛,不要产生气泡. 8. 将细胞悬液转移到15mL的离心管中. 9.

250 g,离心5 min. 10. 小心弃去上清液. 11. 加入2 mL人脂肪间质干细胞无血清培养基重悬细胞. 12. 按照2.0-3.0*104 个活细胞/cm2 的密度来接种细胞,或者按照1:2-1:3的比例来接种细 胞. 13. 接种到Corning T25或者T75培养瓶(CellBIND Surface)中培养;

14. 加入适量的人脂肪间质干细胞无血清培养基,把细胞放入37℃、5%CO

2、饱和湿 度的培养箱中培养. 提示 1. 换液时机 CBPI0481A2 HUXMD-90061 Page

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6 传代后发现有很多死细胞,应该予以换液. 当成人脂肪间质干细胞的完全培养基pH值变酸时(培养液的颜色变黄),而 且此时细胞仍未可以传代,则应该予以换液.一般来说,成人脂肪间质干细胞的 换液间隔为2-3天. 2. 传代时机 当成人脂肪间质干细胞达到80%-90%汇合时,就应该进行传代.不可让成人 脂肪间质干细胞完全融合或过度融合,否则会发生生长接触抑制.这将严重影响 细胞的生长状态. 3. 培养图片 人脂肪间质干细胞在 (Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)无血清 条件的培养基中的培养状态图片. A. 培养第三代的细胞状态 B. 添加1%的灭活血浆培养第三代的细胞状态 提示:如需长期培养细胞建议添加1%的热灭活自体血浆,这样做可获得更多的细胞扩增数 量,可以满足需要大量细胞的实验需要.如果需要细胞量不多,完全不需要添加人血浆成 分,这样获得的细胞将更加稳定和安全. 相关产品 产品名称 货号 OriCell 人脂肪间质干细胞 HUXMD-01001 OriCell 1*PBS溶液 PBS-10001 B A CBPI0481A2 HUXMD-90061 Page