PDF《受理号：CSZ1700127》

扩增文库与带有生物素标记的寡核苷酸探 针进行液相杂交,并用链霉素包被的磁珠对与探针结合的文库 进行捕获富集,最后经过PCR扩增得到捕获文库.捕获文库采 用基因测序仪(型号:NextSeq CN500,杭州贝瑞和康基因诊断 技术有限公司生产,注册证号:国械注准20153400460)进行高 7/28 通量测序.对于测序数据,采用生物信息学软件判读10种基因 中是否存在来自肿瘤的变异.

二、临床前研究摘要

(一)主要原材料 1.主要原材料的选择 该试剂盒主要原材料包括:捕获探针、末端修复酶、连接 酶、DNA聚合酶、对照品等,这些原材料均为外购方式获得, 捕获探针为申请人自行设计后由专业的合成公司合成.申请人 选择有资质的供应商提供的原料,通过功能性试验,筛选出最 佳原材料和供应商.制定了各主要原材料质量标准并经检验合 格. 2. 企业参考品和质控品设置情况 企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品 和重复性(精密度)参考品.其中: 阳性参考品共18份,包括该产品可检出的所有突变或融合 类型,均为DNA样本.其中8份来自临床样本,5份来自混合的 细胞系参考品(由自行购买的不同突变或融合类型的15个细胞 系参考品混合而成) ,5份来自混合人工合成DNA的人类细胞系 参考品(一共含18个不同突变或融合类型) .所有参考品均用 8/28 Sanger测序法和数字PCR方法验证. 阴性参考品共8份,包括1份大肠杆菌样本,7份试剂检测范 围内基因变异阴性的临床样本. 所有样本均用Sanger测序法和数 字PCR方法验证为相关突变阴性. 检测限参考品共10份,包括该产品可检出的所有突变或融 合类型. 其中5份由混合阳性细胞系和试剂检测范围内基因变异 阴性的细胞系DNA稀释获得,5份由人工合成DNA和试剂检测 范围内基因变异阴性的细胞系样本DNA稀释获得.10份检测限 参考品稀释后的突变类型和重排(融合)类型变异比例为1%. 重复性参考品总共15份,包括该产品可检出的所有突变或 融合类型. 其中7份由混合阳性细胞系和试剂检测范围内基因变 异阴性的细胞系DNA稀释获得,7份由人工合成DNA和试剂检 测范围内基因变异阴性的细胞系样本DNA稀释获得, 1份为试剂 检测范围内基因变异阴性的细胞系样本DNA.12份弱阳性参考 品突变比例为1~5%,2份强阳性参考品突变比例为15%,另采 用试剂检测范围内基因变异阴性的细胞系制成1份阴性参考品. 该产品的对照品来源于细胞系样本的DNA,其中阳性对照 品包含EGFR/KRAS基因突变阳性和ROS1基因融合,阴性对照 品为试剂检测范围内10种基因变异阴性,用于检测过程中试剂 和仪器的质量控制. 9/28

(二)生产工艺及反应体系研究 申请人通过对试剂主要生产工艺的研究,确定了最佳生产 工艺. 申请人通过使用初步确定的配方进行反应体系配制,对反 应体系中的样本核酸提取试剂、末端修复试剂用量、连接试剂 用量、接头用量、LC-D7/D5引物用量、杂交文库混合数量、杂 交捕获文库用量、封闭剂用量、捕获探针用量、杂交液用量、 磁珠用量、杂交时间、扩增反应条件等进行筛选和优化,通过 功能性试验,最终确定了最佳的反应体系.

(三)分析性能评估 分析性能评估内容包括阴/阳性参考品符合率、 最低检出限、 分析特异性和干扰物质、重复性、肿瘤组织样本要求研究、核 酸提取纯化配套试剂组合性能研究等. 在阴/阳性参考品符合率试验中,申请人采用18份阳性参考 品和8份阴性参考品对3批成品试剂盒(P215071301Z 、 P215071501Z、P215071701Z)进行了检测验证,检测结果均为 预期的突变型,说明阳性参考品符合率和阴性参考品符合率均 为100% . 同时选取21 个阳性临床样本在3批成品试剂盒(06018010501Z、06018032901Z、06018052101Z)上分别进行 检测,结果均能正确检出. 10/28 在最低检出限试验中, 申请人采用10份检测限参考品对3批 成品试剂盒(P215071301Z、P215071501Z、P215071701Z)进 行了检测验证,结果均能正确检出.同时选取4份经过数字PCR 定量的阳性临床样本(EGFR/ALK/HER2基因变异阳性,含有点 突变、插入缺失突变和基因重排) ,用基因变异阴性的临床样本 配制8级突变频率梯度共32个样本,每个样本分别在3种建库起 始量(10 ng、30 ng和50 ng)下进行了6次重复检测,确定了样 本的检测限为可检测30ng DNA中频率低至1%的突变 (含有点突 变、插入缺失突变和基因重排) . 取15 份经过数字PCR 定量的阳性临床样本(EGFR/ALK/ROS1/HER2/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基 因变异阳性,含有点突变、插入缺失突变和基因重排) ,用试剂 检测范围内基因变异阴性的临床样本配制成1%变异频率,在30ng 建库起始量下, 用 3批成品试剂盒 ( 06018010501Z 、 06018032901Z、06018052101Z)对各样本进行了20次重复检测 验证,最终确定该产品不低于95%检出率时,可检测30ng DNA 中频率低至1%的突变(含有点突变、插入缺失突变和基因重 排) . 在分析特异性试验中,申请人采用试剂盒检测范围内的基 因变异阴性的临床样本DNA,进行不同建库起始量的检测,检11/28 测结果均为阴性,说明产品对不同起始量的阴性临床样本DNA 具有良好的耐受性.对于试剂盒检测范围内的基因变异阳性参 考品,本试剂盒检测结果均为相应型别阳性,没有错检或漏检, 说明本试剂盒能准确检测目标区域的碱基突变状态,检测的变 异类型间不存在交叉反应.本试剂盒能对非人类基因组(大肠 杆菌和肺炎链球菌)DNA进行正常建库,但不能对目标区域序 列进行捕获富集,说明本试剂盒与非人类基因组DNA无交叉反 应. 在干扰物质试验中,申请人在阳性临床样本和阴性临床样 本中分别加入如下干扰物质:坏死组织(等体积) 、乙醇(21.7 mmol/L) 、二甲苯(35 mmol/L) 、蛋白酶K(0.08 mg/mL)然后 进行检测,样本检测结果均与预期一致,说明这些干扰物质在 不高于上述浓度的情况下不会对该产品的结果产生影响. 在重复性试验中, 申请人采用重复性参考品15份在3批成品 试剂盒(P215071301Z、P215071501Z、P215071701Z)上分别 完成20次重复检测,检测结果一致.同时选取了21份临床样本, 在3批成品试剂盒(06018010501Z 、 06018032901Z 、 06018052101Z)上分别完成20次重复检测,检测结果一致. 针对核酸提取纯化步骤,申请人采用临床样本,平行比较 了2种核酸提取试剂盒的提取效果, 根据与该产品的组合性能研 12/28 究结果,确定了1种核酸提取试剂作为样本提取的推荐试剂盒. 在肿瘤组织细胞含量........