PDF《明专利说明书》

(ii) 因为磷酸化酶促反应体系是可逆 反应,所以目的产物海藻糖的产量较低:(iii) 要保持该反应体 系的稳定和顺利延续其酶促反应实际上是困难的. 关于海藻糖的制备,在 F o o d ? C h e m i c a l s ,N o .

8 8 , 67-72页(1992年8月)上题为 Current? Status? of Starch? Application? Development? and? Related? Problems 的章节 中的标题为 Oligosaccharides 的专栏中有报道: 尽管海藻糖具 有广泛的用途,但是通过直接糖转移反应或水解反应的酶促制备海藻 糖的方法在本领域被认为从科学上来讲是不可能的. 因此,以淀粉 为材料酶促制备海藻糖的方法被认为从科学上讲是极为困难的. 业已知道,由淀粉材料,如液化淀粉、环状糊精和麦芽寡糖制备 的淀粉的部分水解产物通常以还原性末端基团为末端单元.在说明书 中,这种淀粉的部分水解产物被称为 非还原性的淀粉部分水解产 物 .这种还原性淀粉部分水解产物的还原能力通常表达为以其干固 体物重计的 葡萄糖当量(DE) 值 .业已知道,还原性淀粉部分 水解产物中那些具有较高的DE 值的产物通常具有较低的分子量和粘 度,以及较高的适宜甜度和反应性,且易与含有氨基的物质如氨基酸 03122564.0 说明书第3/62页5和蛋白质反应,使其品质发生不理想的褐变、发臭和变质.还原性淀粉部分水解产物的这些不利特性根据其DE值有所变化. 且还原性淀粉部分水解产物与其DE 值之间的关系是极为重要的.甚 至在本领域中一直认为要打破这种关系是不可能的. 打破这种关系的唯一途径是一种在较高的氢压下通过氢化还原性 淀粉部分水解产物将其还原性末端基团转化成羟基而将这种水解产物 制成非还原性糖类.不过,这种方法需要高压灭菌锅并耗费大量的氢 和能源,而且还需要较高的水平的控制或安全设施以免发生灾难.还 原性部分淀粉水解产物与所得产物不同,因为前者由葡萄糖单元组成 而后者,即所得淀粉部分产物的糖醇则是由葡萄糖和山梨醇组成,当 将其用在人体上时可能导致出现消化紊乱或腹泻症状.因此,迫切需 要建立一种降低甚至消除还原性淀粉部分水解产物的还原能力而又不 改变以葡萄糖单元作为其组分糖的状况的方法. 本发明的目的是要提供一种新的非还原性糖类及其应用,并由还 原性淀粉部分水解产物来制备,以使打破传统上认为的还原性部分淀 粉部分水解产物和其DE 值之间的关系,并揭示这种非还原性糖类的 新用途. 为达上述目的,本发明人广泛筛选了能产生一种新的非还原性糖 类生成酶的微生物,当这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物时,可 生成具有海藻糖结构的非还原性糖类. 结果,从日本冈山市和Soja 市的土壤中分别分离出了根瘤菌属 (Rhizobium) 的新微生物,命名为 Rhizobium? Sp.M-11 ,和节 杆菌属(Arthrobacter) 的新微生物,命名为 Arthrobacter? Sp. Q36 ;

并发现上述微生物能产生非还原性糖生成酶,当这种酶作用 03122564.0 说明书第4/62页6于还原性淀粉部分水解产物时,能生成具有海藻糖结构的非还原性糖 类,而且当这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物时容易制备出所需 要的非还原性糖类. 我们还发现,通过先将这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物再 将所得非还原性糖类用葡萄糖淀粉酶或α-葡萄糖苷酶处理可很容易 地制备出海藻糖.这样,本发明人完成了这一发明.此外,我们还从 常规微生物中广泛筛选了能产生这种酶的微生物. 结果发现,短杆菌属(Brevibacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、微珠菌属( M i c r o c o c c u s ) 、 弯曲杆菌(Curtobacterium) 和土杆菌属(Terrabacter) 的微生物与根瘤菌 属和节杆菌属的微生物一样能产生这种非还原性糖类生成酶,并且我 们完成了这一发明.另外,我们建立了制备含有这种非还原性糖类及 含非还原性糖类的还原性较低的糖类和/或由这种糖类制成的海藻糖 的组合物如食品、化妆品和药品的制品方法,而且我们完成了这一发 明. 图1 表示温度对由根瘤菌属的Rhizobium? SP.M-11 菌获得的非 还原性糖类生成酶的活性的影响. 图2 表示pH 值对由根瘤菌属的Rhizobium? SP.M-11 菌获得的非 还原性糖类生成酶的活性的影响. 图3 表示由Rhizibium? SP.M-11 菌获得的非还原性糖类生成酶 的热稳定性. 图4 表示由Rhizibium? SP.M-11 菌获得的非还原性糖类生成酶 的pH稳定性. 图5 表示温度对由节杆菌属的Arthrobacter? SP.Q36 菌获得的 03122564.0 说明书第5/62页7非还原性糖类生成酶的活性的影响. 图6 表示pH 值对由Arthrobacter? SP.Q36 菌获得的非还原性糖 类生成酶的活性的影响. 图7 表示由Arthrobacter? SP.Q36 菌获得的非还原性糖类生成 酶的热稳定性. 图8 表示由Arthrobacter? SP.Q36 获得的非还原性糖类生成酶 的pH稳定性. 本发明涉及一种新的非还原性糖类生成酶,以及它的制备和应用. 本发明还涉及能够产生这种酶的微生物,用这种酶所制备的非还原性 糖类含有所说非原性糖类的相对低还原性糖类,由这些糖类制备的海 藻糖、以及含有这些糖类和海藻糖的之一和两者的组合物.本发明人广泛筛选了能够产生一种新的非还原性糖类生成酶的微 生物,当这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物时能生成具有海藻糖 结构的非还原性糖类,最终发现了目标微生物. 现在,本发明人首先阐述该根瘤菌属微生物,即本发明的 Rhizobium? Sp.M-11 菌的鉴定试验.该试验是按照在 Bisebutsu -no-Bunvui-to-Dotei (微生物分类和鉴定)中所述方法进行的. 该书由Takej? Hasegawa 编辑. 由日本科协出版社出版,日本,东京 (1985).结果如下: A.形态学 当在27℃在营养琼脂中培育时细胞的特征: 一般呈0.6~0.8*1.0~1.5μm的杆状;