PDF《Vero 细胞）》

中国药典2015年版 冻干乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞) 冻干乙型脑炎灭活疫苗( Vero细胞) Donggan Yixing Naoyan Miehuoyim iao (Vero Xibao) Japanese Encephalitis Vaccine (Vero Cell), Inactivated, Freeze-dried 本品系用乙型脑炎(以下简称乙脑)病 毒接种于Vero细胞,经培养、收获、灭活病毒、浓缩、纯 化后,加 入适宜稳定剂冻干制成.

用于预防乙型脑炎.

1 基本要求生产和检定用设施、原材料及辅料、水 、器具、动物 等应符合 凡例 的有关要求.

2 制造2.1生产用细胞 生产用细胞为Vero细胞. 2.

1 .

1 细胞管理及检定 应符合 生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检 定规程 规定.各级细胞库细 胞代 次应不超 过批 准的限 定代次. 取自同批工作细胞库的1 支或多支细胞,经复苏、扩 增后的细胞仅用于一批疫苗的生产.

2 .

1 .

2 细胞制备 取工作细胞库中的1 支或多支细胞,细胞复苏、扩增 至接种病毒的细胞为一批.将复苏后的单层细胞用胰蛋 白酶或其他适宜的消化液进行消化,分散 成均匀的细胞, 加人适宜的培养液混合均匀,置35?3

7 C 培养形成致密 单层细胞. 2.2 -毒种

2 .

2 .

1 名称及来源 生产用毒种为乙脑病毒P3 株或其他经批准的Vero细 胞适应株.

2 .

2 .

2 种子批的建立 应符合 生物制品生产检定用菌毒种管理规程 规定. 乙 脑病 毒匕株原 始种 子应 不超 过第 53代 ,主种子批 和工作种子批应不超过批准的限定代次.

2 .

2 .

3 种子批毒种的检定 主种子批应进行以下全面检 定,工作种子批至少应 进行2. 2. 3. 1?2. 2. 3.

5 项检定. 2. 2. 3.

1 鉴别试验 将毒种做10倍系列稀释,取 1CT1?10_5稀释度的病 毒液与乙脑特异性免疫血清等量混合为试验组,取10―? 10一 8稀释度的病毒液与乙脑阴性血[等量混合为对照组, 于37°C水浴90分钟,试验组和对照组每个稀释度分别接 种体重为7?9 g 昆明小鼠或其他品系小鼠6 只 ,每只脑内 注射0,03ml,逐日观察,3 天内死亡者不计(动物死亡数 量应不得超过试验动物 总数 的20%),观 察14天判定结 果 .中和指数应大于500. 2. 2. 3.

2 无菌检查 依法检查(通则1101),应符合规定. 2. 2. 3.

3 支原体检查 依法检查(通则3301),应符合规定. 2. 2. 3.

4 病毒滴定 将毒种做10倍系列稀释,取

10 6?10~9稀释度病 毒液脑内接种体重为7?9 g 昆明小鼠或其他品系小鼠,每稀释度注射小鼠5只,每 只0.03ml,逐日观察,3 天内死亡者不计(动物死亡数量应不得超过试验动物总数的20%),观 察14天.病 毒滴度应不低于8.0 lg L D 5o/ml. 2. 2. 3.

5 外源病毒因子检查 依法检查(通则3302),应符合规定. 2. 2. 3.

6 免疫原性检查 用主种子批毒种制备疫苗,腹腔免疫体重为12?14g N I H 小鼠或其他品系小鼠1

0 只 ,每 只0.3ml,免疫2次,间隔7天,作 为试验组.未 经免 疫的同批小鼠作为对照 组 .初 免后第14天 ,试验组和对照组小鼠分别用不低于

10 000 l d 5. 病毒量的非生产用乙脑病毒P3 株进行腹腔攻 击 ,同时 各组小鼠 每只脑腔 注射0.03ml稀释液,3 天内 死亡者不计(动物死 亡数 量应不得超过试验动物总数的

2 0 % ) .攻击21天后免 疫组应100%保护,对照组死亡率 应不低于80% .

2 .

2 .

4 毒种保存 冻干毒种应于一20°C以下保存;

液体毒种应于一60X: 以 下保存.

2 .

3 原液

2 .

3 .

1 细胞制备 按2. 1.2项进行.

2 .

3 .

2 培养液 培养液为含有适量灭能新生牛血清的199或其他适宜 培养液.新生牛血[的质量应符合要求(通则3604) ,且 乙脑抗体应为阴性.

2 .

3 .

3 对照细胞外源病毒因子检查 依法检查(通则3302),应符合规定.

2 .

3 .

4 病毒接种和培养 细胞生长成致密单层时,弃 去细胞培养液,用 Earle'

s 液 或其他适宜 的洗涤液充分冲洗细胞,除去牛血 清后,加 入MEM维持液.工 作种子批毒种按0.05? 0.3MOI接种(同一工作种子批毒种应按同一MOI接种) .置适宜温度下培养.

2 .

3 .

5 病毒收获 经培养60?84小时,澄 清过滤后 收获 病毒 液.根据 细胞生长情况,可加人新鲜维持液继续培养,进行多次病 毒收获.检定合格 的同一细胞批生产的同一次病毒收获 液可合并为单次病毒收获液.

127 冻干乙型脑炎灭活疫苗(Vem细胞)中国药典2015年版2.3.6单次病毒收获液检定 ? 按3.1 项进行.

2 .

3 .

7 病毒灭活 应在规定的蛋白质含量范围内进行病毒灭活.单次 病毒收获液中加人终浓度为200^g/m l甲醛,置适宜温度 灭活一定时间.病毒灭活到期后,每个病毒灭活容器应 立即取样,分别进行病毒灭活验证试验. 2.

3 .

8 超滤浓缩 同一细胞批制备的多个单次病毒收获液进行病毒灭 活 ,检定合格的病毒液进行适宜倍数的超滤浓缩至规定 的蛋白质含量范围. 2. 3.

9 纯化 浓缩后的病毒液采用蔗糖密度梯度离心法或其他适 宜的方法进行纯化. 2. 3.

1 0 脱糖 采用蔗糖密度梯度离心进行病毒纯化的应以截留分 子质量100kD膜进行超滤脱糠.可加人适宜浓度的稳定 剂 ,即为原液. 2. 3.

1 1 原液检定 按3.

2 项进行. 2.

4 半成品 2. 4.

1 配制 将原液按规定的同一蛋白质含量或抗原含量进行稀 释,总蛋白质含量应不超过SOng/ml, 加人适宜的稳定 剂即为半成品.

2 .

4 .

2 半成品检定 按3.

3 项进行.

2 .

5 成品 2. 5.

1 分批 应符合 生物制品分批规程 规定.

2 .

5 .

2 分装及冻干 应符合 生物制品分装和冻干规程 规定. 2. 5.

3 规格 复溶后每瓶0. 5ml.每1次人用剂量0. 5ml. 2. 5.

4 包装 应符合 生物制品包装规程 规定.

3 检定

3 .

1 单次病毒收获液检定 3. 1.

1 无菌检查 依法检查(通则1101),应符合规定? 3. 1.

2 支原体检 依法检查(通则3301),应符合规定. 3. 1.

3 病毒滴定 按2. 2. 3.

4 项进行,应不低于7.

0 lg LD50/m L

3 .

2 原液检定

3 .

2 .

1 无菌检 依法检查(通则1101),应符合规定. 3. 2.

2 病毒灭活验证试验 ?

128 ? 取灭活后病毒液脑内接种体重12?14g小鼠8只,每只0.0

3 m l,同时腹腔接种0 .5 m l,为第1代;

7天后将 第1代小鼠处死

3 只 ,取 脑制成10%脑悬液,同法脑内 接种12?14g小鼠6只,为 第2代;

7 天后将第2代小 鼠处死3 只 ,同 法脑内接种12?14g小鼠6只,为 第3代,接种后逐日观察14 天,3 天内死亡者不计(动物死 亡数量应不得超过试验用动物总数的20% ) ,每代小鼠 除处死和接种后非特异性死亡的以外,全 部健存为合格.

3 .

2 .

3 蛋白质含量 依法测定(通则0731第二法) ,应符合批准的要求.

3 .

2 .

4 抗原含量 可采用酶联免疫法,应符合批准的要求. 3.

3 半成品检定 3.3.

1 无菌检查 依法检(通则1101),应符合规定. 3. 3.

2 抗原含量 可采用酶联免疫法,应符合批准的要求. 3.

4 成品检定 除水分测定外,应按标示量加人所附灭菌注射用水, 复溶后进行以下各项检定. 3. 4.

1 鉴别试验 采用酶联免疫法检查,应证明含有乙脑病毒抗原. 3. 4.

2 外观 应为白色疏松体,复 溶后应为无色澄明液体,无 异物. 3. 4.

3 水分 应不高于3.0% (通则0832). 3. 4.

4 pH 值依法检查(通则0631),应符合批准的要求-

3 .

4 .

5 渗透压摩尔浓度 依法测定(通则0632),应符合批准的要求.

3 .

4 .

6 游离甲醛含量 应不 高于lOpg/ml ( 通则3207 第一法 3.

4 .

7 效价测定 采用免疫小鼠中和抗体测定法,以蚀斑减少中和试 验测定中和抗体. 参考疫苗(RA和RB) 以及中和试验阳 性血清由国家药品检定机构提供. 将被检疫苗(T)稀释成1=32,参考疫苗(R) 按要求的稀释度稀释,分 别腹腔免疫体重为12? 14g 小鼠10只,每 只0.

5 m l, 免疫2次,间 隔7天.第

2 次免疫后第7天采........