DOC《氯吡格雷活性代谢物在人体内的血药浓度测定（中文题目用3...》

氯吡格雷活性代谢物在人体内的血药浓度测定(中文题目用3号黑休) (空一行) 房文通1,罗璨1,戴惠珍2,孟玲1(作者姓名用5号楷体,如不同单位作者请用阿拉伯数字在姓名右上角标注1,2,3)(1.

南京医科大学第一附属医院,江苏 南京210029;

2.江苏省医药情报研究所,江苏 南京210029) (空一行) (研究性论文摘要按 目的、方法、结果、结论、关键词 ,综述类论文不需按指示式;

不良反应个例报道不用摘要) [摘要] 目的:采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)建立人血浆中氯吡格雷活性代谢产物浓度测定的方法.方法:血浆经冷冻干燥处理,以Accucore C18为色谱柱;

乙腈(含0.01%甲酸)-水(含0.01%甲酸)为流动相,流速:0.4 mL・min-1,柱温:30 ℃,进样量:2 μL;

通过正离子模式多反应监测扫描分析,离子通道分别为氯吡格雷活性代谢产物衍生物(CAMD)m/z 504.2→155.1,内标氯雷他定m/z 382.8→336.9.结果:血浆中氯吡格雷活性代谢产物衍生物在0.5~500 ng・mL-1范围内线性关系良好;

最低检测限为0.5 ng・mL-1;

提取回收率为83.81%~97.65%;

日内和日间精密度的RSD均小于9.86%.结论:本方法准确可靠,简便快速且灵敏度高,适用于人血浆中氯吡格雷活性代谢物的测定,可进一步用于研究氯吡格雷活性代谢产物的药代动力学特征. [关键词] 液相色谱-串联质谱;

氯吡格雷活性代谢物;

血药浓度;

药动学(小五号楷体) (空一行) Determination of clopidogrel active metabolites in human plasma(标题5号Times New Roman粗体) (空一行) WU Hui, CHEN Xin-li, GENG Hua, LI Xue-song(姓全大写,5号Times New Roman)( (Department of Pharmacy, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Yunnan Kunming 650032, China) (空一行) ABSTRACT: OBJECTIVE To develop a LC-MS/MS method for the determination of clopidogrel active metabolites in human plasma. METHODS The plasma was dried. The analytical column was packed with accucore C18. The mobile phase was acetonitrile (0.01% formic acid) and water (0.01% formic acid) at a flow rate of 0.4 mL・min-1, the column temperature was

30 ℃ and the injection volume was

2 μL with electrospray positive ionization (ESI+) and multiple reaction monitoring (m/z 504.2→155.1(CAMD) and m/z 382.8→336.9 (loratadine)). The concentration of CAMD in plasma was detected by this LC-MS/MS method. RESULTS Excellent liner relationship was obtained from the range of 0.5C500 ng・mL-1, the limit determination of CAMD was 0.5 ng・mL-1. The average extraction recovery was 83.81%C97.65%. The inter- and intra-day RSD was less than 9.86%. CONCLUSION The method is accurate, simple and rapid with high sensitivity, which can be used to analyze clinical samples and determine the pharmacokinetics of clopidogrel active metabolites. KEY WORDS: LC-MS/MS;

clopidogrel active metabolites;

plasma drug concentration;

pharmacokinetics (空一行) (正文全文用5号宋体,英文用5号Times New Roman;

文章阶梯段落用

1 , 1.1 , 1.1.1 ……,整个论文行间距用单倍行距) 氯吡格雷(clopidogrel)是目前世界范围内使用最广泛的抗血小板药物,是不稳定型心绞痛和心肌梗死,以及接受经皮冠状动脉介入术患者治疗的基础用药,可以降低病死率和大幅度减少心血管事件的风险[1-2]. 药动学研究[3-4]表明氯吡格雷本身为前体药物,经代谢转化为活性代谢物(硫醇衍生物)后才发挥抑制血小板聚集的作用.因此只有测定血液中的活性代谢药,才能真正反映其疗效.但是由于该药物的体内代谢活性物含量少且稳定性极差,普通体内药物分析方法很难达到要求,目前国内对其研究较少.本研究通过改进Takahashi等[5]的方法,使用冷冻干燥代替蛋白沉淀和固相萃取处理血浆样品,简单易操作、血浆用量少( 0.1 mL)、分析时间短,并运用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)完成对氯吡格雷活性代谢物质的提取、分离和测定.

1 材料与方法 1.1 药品与试剂 氯吡格雷活性代谢产物衍生物(CAMD)标准对照品(Toronto Research Chemicals,纯度>

92%,批号5-MNZ-188-22);

内标氯雷他定(IS)标准对照品(成都药检所,批号100615-201103),2-Bromo-3'

-Methoxyacetophenone(MPB)(东京化成工业株式会社,批号A5505),空白血浆(健康患者提供).乙腈和甲酸为一级色谱纯,实验用水为超纯水. 1.2 仪器 ekspertTM UltraLC 100液相色谱系统,3200 Q TRAP三重四级杆质谱仪,Accucore C18(50 mm*2.1 mm,2.6 μm)色谱柱,箱式冻干机(FTS STD TD-TDS A073 ),分析天平(上海佑科仪器仪表有限公司),XK96-A涡旋混合仪(江苏新康医疗器械有限公司),SC-04低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司). 1.3 实验条件 色谱条件:色谱柱C18(50 mm*2.1 mm,2.6 μm) ;

流动相为乙腈(含0.01%甲酸)-水(含0.01%甲酸),流速为0.4 mL・min-1,柱温30 ℃,进样2 μL,分析时间为8 min,CAMD和IS的保留时间分别为2.65 min和2.34 min.洗脱条件见表1. 表1 梯度洗脱条件(表题用小五号中英文,表内容用中文6号,三线表) Tab

1 Gradient elution conditions 时间/min 流速/mL・min-1 A% B%

0 0.4

90 10

2 0.4

60 40

4 0.4

60 40

5 0.4

90 10

8 0.4

90 10 质谱条件:电喷雾离子源(ESI),正离子方式检测,扫描方式为多反应监测.离子喷雾进样温度400 ℃;

离子源气体GS2(N2)压力10,多反应监测扫描方式定量,m/z 504.2→155.1(CAMD)和m/z 382.8→336.9(IS). 1.4 溶液配制 1.4.1 CAMD标准储备液 精密称取CAMD 0.25 mg,用乙腈溶解,转至5 mL棕色容量瓶,定容,摇匀,配制为50 μg・mL-1的标准储备液,-20 ℃冰箱保存备用. 1.4.2 IS标准储备液 精密称取氯雷他定5.00 mg,用乙腈溶解,转至50 mL棕色容量瓶,定容,摇匀,配制为100 μg・mL-1的标准储备液,-20 ℃冰箱保存备用. 1.4.3 0.01%甲酸溶液 精确吸取甲酸0.1 mL,用乙腈或者超纯水稀释并且定容到1 L,超声5 min后再使用. 1.5 血浆样品处理 1.5.1 样品收集 患者连续服用氯吡格雷(75 mg)6 d后,取患者服药后60 min的外周静脉血2 mL,于含2% EDTA的抗凝管中,立即加入30 μL

500 mmol・L-1 MPB,混匀,室温反应10 min,3

500 r・min-1离心10 min后再1

000 r・min-1离心5 min,然后取上清液用于测定(-80 ℃保存). 1.5.2 样品制备 精确吸取处理后的血浆样品100 μL,加入100 μL内标液,涡旋30 s,转至冷冻干燥.待完全干燥后加入100 μL乙腈溶解,涡旋30 s,4

000 r・min-1离心10 min,取上清液过滤后进样.

2 结果 2.1 方法特异性 取6份100 μL的空白血浆,其中3份各加入100 μL乙腈,涡旋30 s,转至冷冻干燥.待完全干燥后加入100 μL乙腈溶解,涡旋30 s,4

000 r・min-1离心10 min,取上清液过滤后进样,3份平行操作,得色谱图A;

另取空白血浆100 μL 3份,各分别加入CAMD(25 ng・mL-1)和IS(50 ng・mL-1)各100 μL,依同法操作,得色谱图B;

按 1.5 项下操作,取处理后的患者血浆100 μL加内标100 μL,,

得色谱图C.由色谱图( 见图1)可见,CAMD的保留时间为2.65 min,IS的保留时间为2.34 min,峰形及分离均良好,样品中内源性物质不干扰测定. A CAMD IS B CAMD IS C A.空白血浆;

B.空白血浆+CAMD+IS;

C.患者血浆+IS A. blank plasma;

B. blank plasma + CAMD + IS;

C.plasma sample + IS 图1 CAMD及IS在血浆中的色谱图 Fig

1 The MRM Chromatograms of CAMD and IS in human plasma(图请按一定比例缩小,以能看清图中文字为宜;

图题及图注用中英文6号字体) 2.2 标准曲线与定量下限 取CAMD标准储备液,加乙腈稀释为500,250,100,50,25,10,5,1,0.5 ng?mL-1标准溶液.然后取9份100 μL的空白血浆,各分别加入不同浓度CAMD标准溶液和IS各100 μL,涡旋30 s,转至冷冻干燥.待完全干燥后加入100 μL乙腈溶解,涡旋30 s,4

000 r・min-1离心10 min,取上清液过滤后进样.每一浓度平行测定5个样本,测定CAMD的峰强度Is和IS的峰强度Ii,并以Is/Ii为纵坐标及其对应各点的浓度C为横坐标,采用最小二乘法用权重1/X2进行线性回归.求得标准曲线方程:y=0.005 2x+0.386(r=0.998,n=5),结果显示CAMD的线性范围为0.5~500 ng?mL-1,定量下限(LLOQ)为0.5 ng?mL-1 [(0.47±0.077) ng?mL-1,RSD为16.38%,S/N>

5]. 2.3 精密度和准确度 取空白血浆100 μL,加入CAMD和IS各100 μL,按 2.2 项下方法,制备得CAMD高、中、低3个浓度点(250,25,1 ng?mL-1 )的QC样品,每一浓度平行测定5个样本,连续测定3 d,以随行的标准曲线计算QC样品的浓度,经方差分析求得本法精密度(RSD),并与制备浓度比较求得方法的准确度(RE),数据见表2.结果表明,血浆中CAMD的分析方法的RSD与RE均在9.86%和6.00%以内,符合生物样品分析方法要求. 表2精密度和准确度 Tab

2 The precision and accuracy 标示浓度/ng?mL-1 测得浓度/ng?mL-1 日内RSD/% 日间RSD/% RE/%

1 1.06±0.044 4.15 9.86 6.00

25 25.94±1.69 6.52 3.45 3.76

250 253.29±5.80 2.29 2.74 1.32 2.4 提取回收率与基质效应 取空白血浆100 μL,按 2.2 项下方法,制备得CAMD高、中、低3个浓度点(250,25,1 ng?mL-1 )的QC样品,每一浓度平行测定5........