DOC《胶体金试纸条检测H5N1亚型禽流感病毒操作程序》

测试端多余的Au-Ab1在NC膜上继续泳动,别对照处的Ab2捕获,形成第二条棕红色条带.若待检液中不含AIV时,测试端的Au-Ab1在NC膜上泳动,不能被检测线处的Ab1拦截,直接与对照线处的Ab2结合,仅形成一条棕红色条带 4. AIV快速诊断试纸的制作 4.1鼠抗AIV单克隆抗体的制备 用纯化的AIV抗原免疫8日龄的Balb/c小鼠50ug/只,首次免疫用弗氏完全佐剂乳化抗原,加强免疫用弗氏不完全佐剂乳化抗原,共免疫2-3次,每次间隔2-6周.当用ELASA检测AIV血清抗体效价小于104时,用50微升纯抗原尾静脉超强免疫,去脾细胞与骨髓瘤细胞在50%PEG作用下进行细胞融合,HAT选择培养基培养,随后进行阳性克隆筛选,经小鼠腹腔诱生腹水,proteinG柱成析提纯IgG. 4.2兔抗鼠IgG多克隆抗体的制备 首先将Balb/c小鼠的血清采用辛酸-硫酸铵法加以纯化,已获得较纯的小鼠IgG.具体过程为:离心后的一份血清用2份0.01M Ph7.4 PBS稀释,边搅拌边加入50%饱和硫酸铵,4摄氏度澄清2小时,13000r/min离心30min,弃沉淀.上清液调PH值至7.4.在加入35%饱和硫酸铵沉淀蛋白质,重复两次.沉淀物用少量PBS溶解,4摄氏度PBS透析过夜,期间换液3-5次,然后以获得较纯的小鼠IgG作为抗原,加上适量的佐剂,免疫健康的家兔,取血清再次用辛酸-硫酸铵法加以纯化,即制的兔抗鼠IgG多克隆抗体. 4.3胶体金的制备 将氯化金溶解于双蒸水中制成0.01%的水溶液],取0.01%的HauCl4水溶液加热至沸腾,迅速加入1%柠檬酸钠溶液4毫升,约5分钟后出现橙红色,即制成所需的胶体金颗粒,4摄氏度备用. 4.4鼠抗AIV单克隆抗体的标记 取1毫克纯化的鼠抗AIV单克隆抗体,边搅拌边加入到50毫升交替金溶液中室温下搅拌1小时.加入10%牛血清白蛋白2毫升(终浓度为0.4%),室温下搅拌5分钟.加10%聚乙二醇1毫升(终浓度为0.2%),室温下搅拌5分钟.12000-15000r/min离心50min,沉淀溶于5毫升保存液中.用滤膜过滤,4摄氏度冰箱保存备用 4.5金标记鼠抗AIV单克隆抗体玻璃纤维的制备 取3毫升金标记鼠抗AIV单克隆抗体,加3毫升稀释液混均.放入玻璃纤维素膜浸泡10分钟,取出至37度烤箱中烤干,热合封口,置4摄氏度冰箱备用. 4.6. H5N1亚型禽流感病毒快速诊断试纸的组装 将所需材料剪成相应尺寸大小,即手柄端4mmx20mm,抗体硝酸纤维素膜4mmx20mm,金标记鼠抗AIV单克隆抗体玻璃纤维4mmx5mm,加样区4mmx15mm. 然后将这些材料组装成H5N1亚型禽流感病毒快速诊断试纸. 5快速诊断试纸的诊断步骤 5.1采样 取出待检鸡的肺脏和肝脏等发病器官,至于容器内,然后加入生理盐水或干净的自来水,充分剪水或匀浆,静置5分钟. 5.2检测 从4摄氏度冰箱中取出H5N1亚型禽流感病毒快速诊断试纸,恢复到室温,拿试纸的手柄部,将测试端插入组织悬液的上清中,NC膜吸满液体时,取出试纸平放1-5min,管擦NC膜的显色情况. 5.3结果判断 试纸的NC膜上出现两条棕红色色带时,判为阳性,即该鸡感染H5N1亚型禽流感病毒;

只出现一条棕红色对照现时判为阴性;

即该鸡未感染H5N1亚型禽流感病毒;

不出现任何棕红色色带时,表示操作有误或试纸失效. 6.快速诊断试纸的应用前景 近年来,H5N1亚型禽流感病毒已成为危害养鸡业的主要传染病,由于H5N1亚型禽流感病毒感染的鸡群多呈急性感染或/和其他病原体混合感染而影响确诊,使临床剖检和常规的HI、AGP、PCR方法难以满足临床诊断的需要.而快速诊断试纸使用方便,并且具有快速,敏感、特异的特点,一次具有广阔的应用前景.相信在不久的将来,H5N1亚型禽流感病毒快速检测使之必能广泛应用于生产实践中.另外,我们利用胶体金免疫层析技术,还可研制其他疾病的快速诊断试纸,使之更好的为动物检疫、疫病的防治服务. ........