DOC《附件18》

―仪器常数 ―量子效率 I0―激发光强度 ―荧光物质的摩尔吸收系数 L―荧光池厚度,有单位吗 C―荧光物质浓度 对于给定的物质来说,当激发光的波长、强度、荧光池厚度一定,浓度较低时,上述关系可以简写为: F = KC…2) 即荧光强度与所测定的荧光物质浓度成比例,由此可绘制校正曲线.而后在完全相同的条件下测量未知试样的荧光强度,根据校正曲线得到所测定物质的含量. 荧光寿命测定 荧光寿命的测试一般采用时间相关单光子计数法(time correlated single photon counting),简称 TCSPC法 ;

或频闪分时法,简称 STROB 法.TCSPC的基本原理是,脉冲光源激发样品后,样品发出荧光光子信号,每次脉冲后只记录某一波长单个光子消失的时间t,经过多次计数,测得荧光光子出现的几率分布P(t),此P(t)曲线就相当于激发停止后荧光强度随时间衰减的I(t)曲线(图1).在STROB中,样品被脉冲光源激发,与脉冲光源同步,电压脉冲启动或按一定方式延迟启动光电倍增管,光电倍增管按预设时间门检测样品的荧光强度(图2).在实际应用中,TCSPC法和STROBE方法互为补充. 图1 时间相关单光子计数(TCSPC)法的原理图 图2频闪分时(STROBE)法的原理图 荧光偏振分析 荧光偏振(P)和荧光各向异性(r)定义为: 其中 I//表示激发偏振器与发射偏振器取向互相平行时所测得的垂直偏振发射光强度;

I⊥表示激发偏振器与发射偏振器取向互相垂直时所测得的水平偏振发射光强度. 由于单色器和光电倍增管等对垂直和水平两个偏振成分的敏感度可能不同,因而严格的测定需要引入校正因子G,定义G为水平偏振光激发样品时,仪器对垂直偏振光的透射效率与对水平偏振光透射效率之比,为G=IHV/ IHH IHV为起偏器水平取向而检偏器垂直取向时测得的荧光强度,IHH为起偏器和检偏器均为水平取向时测得的荧光强度.仪器不同,波长不同,G值都可能不同,应分别测定. 经校正后的荧光偏振度: 经校正后的荧光各向异性: 光致发光量子产率测定 光致发光量子产率的测定有参比法和绝对法两种. 参比法也称相对法,是用已知量子产率的荧光标准物质作为参比对待测荧光试样进行光致发光量子产率的测试.在相同激发条件下,分别测定待测荧光试样和参比荧光标准物质两种稀溶液的积分荧光强度(即校正荧光光谱所包括的面积),以及对该激发波长入射光的吸光度,再将这些值分别代入以下公式进行计算: 3) 式中: QYU――待测物质的光致发光量子产率;

QYST――参比物质的光致发光量子产率;

FU――待测物质的积分荧光强度;

FST――参比物质的积分荧光强度;

AU――待测物质在特定激发波长的入射光的吸光度;

AST――参比物质在特定激发波长的入射光的吸光度. 由此可得到待测荧光物质相对于参比物质的量子产率. 注:运用参比法测定光致发光量子产率只适用于液体样品,一般要求吸光度AST、Au低于0.05,在选择参比标准样时,需要选择与待测荧光物质激发光谱和发射光谱相近的参比物质,且激发和发射谱不重叠. 绝对法是采用积分球对光致发光量子产率进行测量.积分球内表面涂有一层高反射性材料,如聚四氟乙烯、硫酸钡等.待测样品各个方向的发射光经过积分球均匀化后从出射口出来,并经过单色器最后被检测器所检测.绝对光致发光量子产率适用于液体、固体、薄膜和粉末样品. 同步荧光扫描分析 在同步荧光扫描中,激发和发射光谱仪以预设的偏移量进行扫描.同步荧光分析可以简化谱图,提高选择性,减少光散射干扰,适合多组分混合物的分析.同步荧光法按扫描方式的不同可分为恒波长法、恒能量法、可变角法和恒基体法. 三维荧光光谱分析 荧光强度是激发和发射这两个波长变量的函数.三维荧光光谱能够获得激发波长和发射波长同时变化时的荧光强度信息,能够获得比常规荧光光谱更完整的光谱信息,可判断未知物的最佳激发波长和最强发射波长,是一种有价值的光谱指纹技术.常用的三维荧光光谱的表示形式有两种:等角三维投影图和等高线线光谱图. 时间分辨发射光谱分析 普遍采用以下几种测量技术: 一种是Boxcar 即取样积分技术,脉冲光激发后的发光信号由光电倍增管接收后,经过一个电子开关,这个开关开通的时刻(激发后tj)以及开通的持续时间(tp)可控.这样,只有(tj, tj +tp)时间内的那部分发光信号能够通过开关进入积分器进行平均.如果固定延迟时间tj,而光谱仪扫描,就可以得到光谱I(λ, t j),即激发后tj 时刻的时间分辨光谱;