DOC《附件2（略）》

08228 Terrassa, Barcelona, Spain 附件4 美洛昔康每日允许摄入量和 最高残留限量(试行) 申报单位参照欧盟有关标准制定了美洛昔康的每日允许摄入量(ADI)和美洛昔康在猪及牛组织中的最高残留限量(MRLs),如下表: 活性成分 ADI 残留 标示物 动物 品种 靶组织 MRLs 美洛昔康 75μg/kg b.w. 美洛昔康 猪和牛 肌肉 20μg?kg-1 肝脏 65μg?kg-1 肾脏 65μg?kg-1 牛 牛奶 15μg?kg-1 附件5 美洛昔康残留检测方法标准(试行) 动物性组织中美洛昔康残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

1 范围 本标准规定了动物性组织中美洛昔康残留检测的制样和液相色谱-串联质谱法测定方法. 本标准适用于猪和牛的肌肉、肝脏、肾脏及牛奶中美洛昔康残留量的检测.

2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修定版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准. GB/T

6682 分析实验室用水规格和试验方法

3 原理 试料中残留的美洛昔康,经蛋白酶酶解后,用磷酸二氢钠缓冲液与二氯甲烷提取(牛奶样品不需酶解直接提取),固相萃取柱净化,正己烷液-液萃取除脂,液相色谱-串联质谱法测定,内标法定量.

4 试剂和材料 以下所用的试剂,除特别注明者外均为分析纯试剂;

水为符合GB/T 6682规定的一级水. 4.1 美洛昔康对照品(C14H13N3O4S2),纯度大于99.9%. 4.2 美洛昔康-D3对照品(C14H10D3N3O4S2),纯度大于99.9%. 4.3 超纯水 由Milli-Q超纯水仪制取. 4.4 柠檬酸 4.5 磷酸二氢钠 4.6 二氯甲烷 色谱纯. 4.7 无水硫酸钠 4.8 乙腈 色谱纯. 4.9 甲醇 色谱纯. 4.10 正己烷 色谱纯. 4.11 蛋白酶:Type VIII,来源于地衣芽孢杆菌. 4.12 固相萃取柱:正相硅胶柱,500mg/3mL,或效能相当者. 4.13 滤膜 滤膜孔径为0.2?m. 4.14 美洛昔康贮备液(1mg/mL):准确称取美洛昔康对照品10mg,置10mL容量瓶中,用0.2mol/LNaOH溶液1.5mL溶解,用甲醇稀释至刻度,配成浓度为1mg/mL贮备液.-20℃贮藏,有效期6个月. 4.15 美洛昔康-D3内标贮备液(100?g/mL):准确称取美洛昔康-D3对照品1mg,置10mL容量瓶中,用0.2mol/LNaOH溶液1.5mL溶解,用甲醇稀释至刻度,配成浓度为100?g/mL贮备液.-20℃贮藏,有效期6个月. 4.16 美洛昔康标准工作液(100?g/mL):精密量取1mL美洛昔康贮备液于10mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度.-20℃贮藏,有效期6个月. 4.17 美洛昔康-D3内标工作液(1?g/mL):精密量取0.1mL美洛昔康-D3内标贮备液于10mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度.-20℃贮藏,有效期6个月.

5 仪器和设备 5.1 超高效液相色谱-串联质谱仪 配电喷雾离子源. 5.2 分析天平 感量0.00001g. 5.3 天平 感量0.01g. 5.4 组织匀浆机 5.5 水浴摇床 5.6 高速冷冻离心机 5.7 涡旋混合器 5.8 氮吹仪

6 试样的制备与保存 6.1 试料的制备 取适量新鲜或解冻的空白或供试组织,绞碎,并使均质. ――取均质的供试样品,作为供试试料 ――取均质的空白样品,作为空白试料. ――取均质的空白样品,添加适宜浓度的标准工作液,作为空白添加试料. 6.2 试料的保存 -20°C以下保存.

7 测定步骤 7.1 提取 7.1.1组织 准确称取组织1g,精密加入1?g/mL内标工作液10?L,涡旋1min,静置15min,加0.75mg/mL蛋白酶溶液(现用现配)4mL,涡动1min,50℃水浴摇床过夜.冷至室温,加2.25mol/L柠檬酸溶液1.5mL,涡旋1min混匀,加入0.15mol/L磷酸二氢钠溶液10mL,二氯甲烷15mL振摇30s,4000rpm离心5min,将下层的二氯甲烷层用吸管取至另一离心管中,水相加二氯甲烷10mL重复提取一次,合并二氯甲烷层备用. 7.1.2 牛奶 精密量称取牛奶2g,精密加入1?g/mL内标工作液20?L,涡旋1min,静置15min,加0.2mol/LHCl溶液200?L,乙腈2mL,涡旋2min,4000rpm离心5min,取上清液,加0.15mol/L磷酸二氢钠溶液10mL,0.2mol/LNaCl溶液2mL,二氯甲烷15mL振摇30s,4000rpm离心5min,将下层的二氯甲烷层用吸管取至另一离心管中,水相加二氯甲烷10mL重复提取一次,合并二氯甲烷层备用. 7.2 净化 预先在针筒内垫滤纸,加无水硫酸钠5g,连接到固相萃取柱上,用二氯甲烷5mL活化,备用液全部上柱,再用二氯甲烷5mL洗试管后上柱.用20%乙腈的二氯甲烷溶液5mL洗脱.40℃水浴氮气吹干,用甲醇1mL复溶,涡旋1min,超声2min,加水1mL混匀.加入甲醇饱和的正己烷溶液4mL,涡旋1min,10000rpm离心10min,弃正己烷层,14000rpm离心20min,取上清液滤过,供超高效液相色谱-串联质谱测定. 7.3 基质匹配标准曲线的制备 空白样品按7.1和7.2项下方法进行处理后,在空白试料经提取净化后的残余物中加入适量的美洛昔康标准工作液和美洛昔康-D3内标工作液制备基质匹配标准溶液,对应组织样品添加浓度分别为