DOC《附录2》

一、动物源大肠杆菌的分离与鉴定 1范围 本方法规定了用于动物源大肠杆菌分离与鉴定的方法. 本方法适用于各种动物中大肠杆菌的分离与鉴定.

2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其它设备和材料如下. 2.1 冰箱:2-4℃和-20℃. 2.2 恒温培养箱:36±1℃. 2.3 电子天平:感量0.1g. 2.4 显微镜:10*--100*. 2.5 生物安全柜. 2.6 生化鉴定卡或商品化试纸条. 2.7 采样管或商品化采样棉拭子. 2.8 微量加样器:1μL~1000μL. 2.9 吸头(与微量加样器匹配).

3 培养基和试剂 3.1 运送培养基. 3.2 麦康凯琼脂. 3.3 大肠杆菌阳性血清.

4 大肠杆菌分离与鉴定程序 大肠杆菌分离与鉴定程序见图1. 图1:大肠杆菌分离与鉴定程序

5 操作步骤 5.1 采样 选择养殖场或屠宰场,灭菌棉拭子采集动物肛门或泄殖腔样品,置入运送培养基中,保存时间不超过48小时. 5.2 大肠杆菌的分离 5.2.1 拭子接种于麦康凯琼脂平板,36±1℃培养18-24h;

5.2.2 挑取粉红色、边缘光滑的可疑菌落,麦康凯琼脂纯化一代, 5.2.3 纯化后可疑菌落接种营养琼脂平板纯化,36±1℃培养16-18h,待进一步细菌鉴定. 5.3 大肠杆菌的鉴定 对于已纯化的菌落,可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定. 必要时,采用大肠杆菌标准血清进行血清型鉴定.

二、动物源沙门氏菌的分离与鉴定 1范围 本方法规定了用于动物源沙门氏菌分离与鉴定的方法. 本方法适用于各种动物中沙门氏菌的分离与鉴定.

2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其它设备和材料如下. 2.1 冰箱:2℃-4℃和-20℃. 2.2 恒温培养箱:36℃±1℃和42℃±1℃. 2.3 电子天平:感量0.1g. 2.4 显微镜:10*--100*. 2.5 生物安全柜. 2.6 恒温水浴锅:37℃~100℃. 2.7 PCR仪. 2.8 电泳仪. 2.9 电泳凝胶成像分析系统(或紫外透射仪). 2.10 冷冻离心机. 2.11 采样管或商品化采样拭子. 2.12 小型离心管. 2.13 微量加样器:1μL~1000μL. 2.14 吸头(与微量加样器匹配). 2.15 漩涡仪. 2.16 微波炉.

3 培养基和试剂 3.1 标准菌株:沙门氏菌CVCC

541 3.2 DNA Maker 3.3 Taq DNA 聚合酶 3.4 dNTP 3.5 琼脂糖 3.6 5*TBE缓冲液 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 54.0g 硼酸 27.5g 0.5M EDTA(pH8.0)20mL 加纯净水至 1000mL 3.7 50*TAE?buffer 三羟甲基氨基甲烷(Tris)242g NA2EDTA.2H2O ? 37.2g 醋酸 57.1ml 加纯净水至 1000mL 3.8 invA基因引物 上游为5′-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3′ 下游为5′-TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C -3′ 3.9 运送培养基. 3.11 沙门氏菌显色琼脂或XLT4琼脂. 3.12 沙门氏菌阳性血清. 3.13 四硫磺酸盐增菌液(TTB). 3.14 亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC). 3.15 核酸染料. 3.16 氯化钠.

4 沙门氏菌分离与鉴定程序 沙门氏菌分离与鉴定程序见图2. 图2 沙门氏菌的分离和鉴定程序

5 操作步骤 5.1 采样 选择养殖场或屠宰场,用灭菌棉拭子采集动物泄殖腔或肛门样品,置入运送培养基中,保存时间不超过48小时. 5.2 沙门氏菌的分离 5.2.1 将拭子置于SC增菌液,36±1℃培养18~24h 或TTB增菌液,42±1℃培养22~24h. 5.2.2 将菌液混匀,接种沙门氏菌显色培养基,36±1℃培养22-24h或接种XLT4琼脂,42±1℃培养22-24h. 5.2.3 挑取沙门氏菌显色培养基上紫色可疑菌落或XLT4琼脂培养基上中央黑色边沿透明的可疑菌落,接种营养琼脂平板,36±1℃培养16-24h,待进一步细菌鉴定. 5.3 沙门氏菌的鉴定 5.3.1 生化鉴定 对于已纯化的菌落,可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定,或者通过5.3.2的方法进行分子生物学(PCR)鉴定. 必要时,用沙门氏菌标准血清进行血清型鉴定. 5.3.2 PCR法鉴定 5.3.2.1 PCR模板的制备 用接种环从营养琼脂上挑选16-24h的纯培养物,置于0.5mL灭菌生理盐水中,12000r/min离心2min,弃上清.再加0.5mL灭菌水,悬浮并涡旋混匀,100℃沸水中煮沸10min后,移至冰上,冷却后以12000r/min离心2min,取上清液为PCR模板. 5.3.2.2 PCR反应体系的配制 根据不同厂家PCR试剂用量,配制PCR反应体系,扩增片段长度约284 bp. 5.3.2.3 PCR反应条件 95℃预变性5min,94?C变性30s, 64?C退火30s,72?C延伸30s, 30个循环,最后72?C延伸10min,同时设立阴性和阳性对照. 5.3.2.4 电泳 5.3.2.4.1 1.2%琼脂糖凝胶板的制备 称取1.2g琼脂糖,加入100mL0.5*TBE(或1*TAE)缓冲液中,加入核酸染料,依据样品数选用适宜的梳子,琼脂糖溶化后混匀倒入在水平台面上的凝胶盘中,胶板厚5mm左右.待凝胶冷却凝固后拔出梳子,取出胶块放入电泳槽中,加0.5*TBE(或1*TAE)缓冲液淹没胶面. 5.3.2.4.2 加样 取10?LPCR扩增产物和3?L上样缓冲液混匀后加入加样孔,每次电泳时,各做一个阳性对照和阴性对照. 5.3.2.4.3 电泳条件 电压110V,电泳时间30min. 5.3.2.5 结果判定 电泳结束后,取出胶块置于紫外投射仪上打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像分析. 如果某一待检样品扩增产物的条带与沙门氏菌阳性对照的条带在一条直线上,即条带与加样孔的距离相同,而阴性对照无此条带,则该样品分离到的菌株可初步判........