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朝阳科技大学 生化科技研究所 硕士论文 黑菌素制备与分析研究探讨 Preparation and Analysis of Destruxins from Metarhizium anisopliae 指导教授:曾耀铭 博士 刘炳岚 博士 研究生:许惠婷 中华民国

101 年7月31 日 朝阳科技大学生化科技研究所 Grauate Institute of Biochemical Sciences and Technology Chaoyang University of Technology 硕士论文 Thesis for the Degree of Master 黑菌素制备与分析研究探讨 Preparation and Analysis of Destruxins from Metarhizium anisopliae 指导教授:曾耀铭 博士 (Dr.

Yew-Min Tzeng) 刘炳岚 博士 (Dr. Bing-Lan Liu) 研究生:许惠婷 (Hui-Ting Shu) 中华民国

101 年7月31 日July 31,

2012 I 摘摘摘摘要 要要要黑菌属(Metarhizium)是昆虫病原真菌的一属 , 常在世界各地农业害虫 及疾病媒介控制方案中,被作为化学杀虫剂替代品.广泛使用真菌的二次 代谢产物包括黑菌作为生物杀虫剂,已经增强其基本生物学的兴趣.黑 菌已被广泛用於合成环状六缩酚酸胜肽―称为黑菌素,乃是由α-羟基 酸及五个胺基酸残基组成.事实上,环缩酚酸胜肽加上天然环胜肽,合并 成具有一个以上酯键连结为特色之天然产物大家族,这一类天然产物,因 其表现出的多样化生物活性而在科学界引起广大兴趣,包括抗癌、抗生素、 抗真菌、免疫抑制剂或抗发炎活性,与其有趣的作用机制及引人注意的分 子结构一致.本实验中以5 L搅拌式发酵槽发酵培养黑菌,再以乙酸乙酯 萃取出其成分,并且利用毛细管电泳分析与定量黑菌素,进一步以半制 备型HPLC分离纯化.实验结果显示,毛细管电泳分析条件为40 mM Sodium broate、pH 9.

8、15 kV、215 nm、57 cm*50 ?m*37.5 ?m即有相当好的分析 效果.而质谱方面,destruxin B分子量为593,经由ESI-MS正离子模式可得 到m/s 594,ESI-MS/MS分析可得到分子量481之片段离子. 关键词 关键词 关键词 关键词:黑菌、黑菌素、毛细管电泳 II ABSTRACT Metarhizium is a genus of entomopathogenic fungi used world-wide as alternatives to chemical insecticides in agricultural pest and disease-vector control programs. The wide utilization of M. anisopliae as bioinsecticide has increased interest in its basic biology, including its fungal secondary metabolites.M. anisopliae has been widely used for synthesis of cyclic hexadepsipeptides,known as destruxins (dtxs) which consist of an α-hydroxyl acid and five amino acid residues.together with natural cyclic peptides, emerge as a broad family of natural products characterized by the occurrence of at least one ester linkage. The great interest that this class of natural products has elicited in the scientific community is explained by the diverse range of biological activities that they exhibit, including antitumoral, antibiotic, antifungi, immunosuppressant, or anti-inflammatory activities, coincidence with intriguing mechanisms of action and attractive molecular architectures. The destruxin used in this study were isolated and purified from submerged culture.Qualitative and quantitative analysis was performed on a capillary electrophoresis system. The optimum conditions were pH 9.8,

40 mM Sodium broate, 10% acetonitrile, at voltage

15 kV, and detected wavelength

214 nm. The ESI mass spectrum shows an abundant protonated molecule (dxt B), [M+H]+ m/z 594, and the m/z

481 product ion was detected from MS2 analysis of m/z

594 fragmentation. Keywords: Metarhizium anisopliae, Destruxins, Capillary Electrophoresis III 致谢 致谢 致谢 致谢 时间飞逝,二年的研究生活即将结束,在朝阳的这段日子里让我成长 了许多.承蒙曾耀铭博士和刘炳岚博士两位恩师的时时鼓励及相助,耐心 指导与细心釜正,让我在求学阶段获益良多,指导我在做事上应有积极、 细心的态度,方能使论文顺利付梓,浩瀚施恩,仅志卷首,由衷感谢. 感谢腾纬、纪珍、辉钦、婉君、雅婷、建德、伟健、士廷、宗豪、亚 道等学长姐们在实验上的教导并提供宝贵经验,使实验进行更加顺利.谢 谢同窗书涵、咳濉㈥酪恰⑼⒄恰F昌以及芷岑、孟哲、沛清、F祈、百鸣、龙腾、朝瑞、楷敬、意宜、冠章、雅慰、轩育、俐i、庭羽、 惟豪、婉凌、盛发、奕嘉、佳汶等实验室的学弟妹们,你们就像家人一样, 你们的陪伴让两年的研究生活变得绚丽多彩.最后要感谢我的父母与家 人,有你们的鼓励与支持才能让我朝著自己的目标前进,求学路途无后顾 之忧.另外还有很多曾经帮助过我的朋友,因为有大家的帮助,我才能有 今天的成果. IV 总目录 总目录 总目录 总目录 摘要.I ABSTRACT II 致谢.III 总目录.IV 图目录.VI 表目录.VII