PDF《黑鲷精子的超低温冻存及 DNA 损伤的 SCGE 检测》

Spermatozoa;

Cryopreservation;

Sperm motility;

Fertilization rate;

DNA damage;

SCGE 黑鲷(Sparus macrocephalus)是我国名贵的海 产经济鱼类,东南沿海重要的养殖种.开展黑鲷精 子超低温冻存研究,建立优质精子的超低温冻存 库,对其种质资源的保护、养殖品种的改良具有重

152 动物学研究30 卷 要意义.有关黑鲷精子超低温冻存的研究已有报道 (Hong et al, 1997;

Jiang et al, 1999;

Li et al, 2001) , 但精子的冻存效果(如激活率、运动时间及受精率 等)与鲜精有一定差距.迄今为止,黑鲷冻精核 DNA 损伤研究尚未见报道.精子 DNA 损伤状况是 衡量精子质量的重要依据之一.单细胞凝胶电泳 (single-cell gel electrophoresis,SCGE)或称彗星 试验(comet assay)是一种检测 DNA 损伤的经典 方法.细胞通过裂解、DNA 解链等过程,经电泳使 损伤的 DNA 从细胞核中溢出,朝阳极泳动,形成 尾状带,即彗尾,未损伤的 DNA 部分保持球形, 两者共同形成 彗星 .彗尾的长度代表 DNA 迁移 距离,荧光染色后彗尾的荧光强度与 DNA 损伤度 相关,由此可以检测单个细胞的 DNA 损伤.由于 能在荧光显微镜下直接观察细胞DNA的损伤情况, 且具有快速、简便及灵敏的特点,已被应用于人类 精子(Lu et al,2002;

Xu et al,2000)以及鱼类精 子(Labbe et al,2001;

Zilli et al,2003;

Xu et al, 2005)DNA 损伤检测中. 本研究以 Cortland(Wolf,1963)溶液为稀释 液,DMSO 为抗冻剂,0.5mL 的麦细管为冻存管进 行黑鲷精子的超低温冻存试验.测定了冻精与鲜精 的活力(激活率、运动时间及寿命)与受精率,并用SCGE 法检测了以 5%―30%DMSO 为抗冻剂的 超低温冻存精子核 DNA 的损伤情况,旨在为黑鲷 精子超低温冻存技术改进及冻精质量的检测提供 参考.

1 材料与方法 1.1 材料性成熟的黑鲷亲鱼于

2008 年4月取自浙江省 宁波市海洋与渔业研究院横码基地苗种场,鱼体重 1―2kg/尾,雄鱼

5 尾、雌鱼

3 尾,供采精、卵用. 1.2 方法1.2.1 精液的采集与稀释 将黑鲷雄鱼用鱼夹固 定, 用洁净的毛巾擦干生殖孔周围体表, 轻压鱼腹, 使精液自然流出,获得无尿、粪便及血污的精液, 经镜检精子活力在 90%以上者用于试验.精液稀释 液为Cortland溶液(NaCl 7.25 g/L,KCl 0.38 g/L, CaCl2 0.18g/L, NaHCO3 1.00g/L, MgSO4・7H2O 0.23 g/L,NaH2PO4・2H2O 0.41 g/L,C6H12O6 1.00 g/L, pH=7.00) ,抗冻剂为DMSO.先将稀释液与DMSO 按一定比例混合后放置于冰箱 (4℃)预冷,再将 精液与上述混合物按

1 3 ∶ 比例混匀成精液-稀释液 混合物,于4℃平衡 10―15min. 1.2.2 冷冻与解冻 将平衡过的精液-稀释液混合 物分装入体积为 0.5mL 的麦细管中 (每支麦细管盛 装约 0.4mL) , 平放在离液氮面 3―5cm 处5―8min 后,投入液氮中保存.同一 DMSO 浓度重复保存

4 ―6 支.解冻时将麦细管从液氮中快速取出,放入 40℃水浴中摇动溶化. 1.2.3 鲜精与冻精的活力及受精率测定 按Jiang et al(2000a)的方法测定鲜精与冻存 30d 后精子的 活力(激活率、运动时间及寿命) . 精子的激活率是指精液与激活液(盐度

28 的 过滤海水)混合后,于显微镜下观察运动精子的数 量占全部精子数量的百分比;

精子的运动时间指精 子自激活开始至 90%的精子原地颤动为止的时间;

精子的寿命指精子自激活开始至 90%的精子停止 运动所经历的时间.实验重复

4 次. 采用干法授精, 即将鲜精 (约5?L) 和冻精 (约20?L)分别与卵(约0.5mL)混匀,10min 后加过 滤海水洗卵