PDF《黑鲷精子的超低温冻存及 DNA 损伤的 SCGE 检测》

2 次,受精卵置于 1000mL 烧杯中(盛 过滤海水 800mL) ,于室温(21―24℃) 、微充气条 件下孵育.胚胎发育到原肠胚中期时测定受精率. 实验重复

4 次. 1.2.4 鲜精与冻精DNA损伤的SCGE检测 步骤: ①稀释,冻存 30d后解冻的精液用 4℃的PBS (pH=7.4) 离心洗涤两次 (2000r/min) , 每次 5min. 鲜精及冻精均用PBS稀释至约 8*106 个/mL, 取50?L 稀精液与

350 ?L浓度为 1%的液态低融点琼脂糖凝 胶(LMA)混匀于

5 mL离心管中.精液最终浓度 约106 个/mL. ②裂解, 加入裂解液 (2.5mol/L NaCl, 100mmol/L EDTA,10g/L肌氨酸钠,pH 10,临用 前加 1%Triton X-100,10% DMSO) ,10℃下裂解

1 h.③消化,加入消化液(2.5mol/L NaCl,5mmol/L Tris,0.5g/L肌氨酸钠,pH 7.4,临用前加 0.5g/L蛋 白酶K) ,55℃水浴

3 h,将精子核蛋白及其他杂蛋 白消化掉.④铺片,PBS洗涤

2 次,70℃水浴加热 3min,使LMA融化成液态,取100?L加在普通载玻 片上,加盖盖玻片 10℃下冷凝 10min.⑤解旋,将 玻片在碱性电泳液 (300mmol/L乙酸钠, 100mmol/L Tris,HCl调节pH至10.0)中浸泡

30 min,使精核 DNA双链解旋. ⑥电泳, 在电压 15V、 电流 130mA 条件下电泳 60min.⑦中和,Tris-HCl(0.4mol/L, pH7.0)中和 15min.⑧染色,EB(50?g/mL)染色

2 期叶霆等:黑鲷精子的超低温冻存及 DNA 损伤的 SCGE 检测

153 10min.⑨观察,Nikon 80i荧光显微镜于激发光波 长580nm下观察,随机观察

100 个精子核,并拍摄 彗星图片.每组(同一抗冻剂浓度)做4个平行样. 统计学处理:①彗星图片的分析处理,采用 CometScore 1.5 软件分析处理,获得彗星全长、尾 长及彗星拖尾中 DNA 的量占细胞总 DNA 的比例 等参数.②彗星率与损伤系数计算,彗星率=(彗 星细胞数目/总细胞数目)*100%;

损伤系数=[(0 级损伤的细胞个数*0)+(Ⅰ级损伤的细胞个数*1) +(Ⅱ级损伤的细胞个数*2)+(Ⅲ级损伤的细胞个 数*3)+(Ⅳ级损伤的细胞个数*4)]. 所有实验数据和组间单因素方差分析采用 SPSS 11.5 完成,以P = 0.05 为检验水准,统计结果 以平均值与标准误差(x _ ±s)表示.

2 结果2.1 黑鲷冻精的活力及受精率 鲜精及超低温冻存

30 d 后的黑鲷精子的活力 (激活率、运动时间及寿命)与受精率测定结果见 表1.由表

1 可见,D1―D4 组冻精的活力及受精 率与对照组的鲜精相比差异不显著,其中 D2 组冻 精的活力与受精率最高,接近鲜精水平.D

5、D6 组冻精的活力及受精率与鲜精相比差异显著.统计 分析表明,黑鲷冻精的受精率与激活率呈线性正相 关(图1) . 2.2 黑鲷冻精的 DNA 损伤 鲜精和

6 组冻精的 SCGE 检测结果显示,彗星 全长和尾长随抗冻剂 DMSO 浓度的升高而增大, 其中D1―D4 组冻精的彗星全长及尾长与鲜精相比差 异不显著,D

5、D6 组冻精的彗星全长及尾长与鲜 精相比差异显著(表2) . 根据彗星拖尾中 DNA 的量占细胞总 DNA 的 比例,将本研究的黑鲷鲜精及冻精的 DNA 损伤程 表1黑鲷鲜精及冻精的活力与受精率(n=400, x _ ±s) Tab.

1 Motility and fertilization rate of fresh sperm and frozen-thawed sperm (n=400, x _ ±s) 组别 Group 激活率 Activation rate (%) 运动时间 Moving time (min) 寿命 Living time (min) 受精率 Fertilization rate (%) 鲜精 94.21±3.03 42.32±4.23 55.61±4.76 91.16±2.92 D1 89.72±1.54 36.23±3.55 50.63±3.95 85.77±4.27 D2 92.91±1.25 39.90±2.70 53.82±2.84 89.35±1.99 D3 88.61±2.05 35.84±3.54 48.53±2.23 87.56±4.86 D4 8........