PDF《付再萍》

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1 .

2 .

2 狗脊基因组 DNA 的检测 利用 UV\2401PC(日本岛津)紫外分析检测仪检测在

260 nm 、

280 nm 的OD 值,DNA 样品的浓度 = OD260 * N(样品稀释倍数) * 50/1

000 ;

再以

1 . 2% (w /v)琼脂糖凝胶电泳的方法检测 DNA 的完整性 .

1 .

3 引物序列(由上海生工生物工程技术服务有限公司提供) 表1引物序列 编号 序列 编号 序列 S8 GTCCACACGG S11 GTAGACCCGT

2 结果图16个样地狗脊基因组 DNA 电泳结果

2 .

1 狗脊基因组 DNA 的完整性和纯度 使用改良的 CTAB 法对狗脊叶子进行 DNA 提取时 , DNA 样品的色泽为白色 . 取15 μLDNA 样品溶于435 μL双蒸 水中 , 混匀 , 测得 DNA 浓度为

55 .

35 ng/μL , OD260 /OD280 =

1 .

827 . 说明所获得的 DNA 纯度较高 . 对10 μLDNA 进行琼脂 糖凝胶电泳分析显示(图1) , 狗脊基因组 DNA 电泳得到的条 带比较整齐 、 清晰 , 基本无降解 , 完整性较好 . 由此可以说明 , 所 提取的 DNA 的质量和产量都较高 .

2 .

2 PCR\RAPD 反应体系的优化 对于要求检测大量样本的遗传多样性和居群遗传结构研究来说 , 检测手段的实验稳定性至关重要 [9] . 很多研究证明 RAPD 对PCR 反应的条件比较敏感 [5\8] . 容易造成两种极端现象 , 一种是非特异性扩增严 重,即产生很多条不确定的产物甚至是无目的产物 , 另一种可能没有扩增条带 . 所以 , 有必要针对不同的实 验材料进行 RAPD 反应体系的优化 . M : marker

1 ~

8 分别是 Mg2 + 浓度 :

0 .

5 、

1 、

1 .

5 、

2 、

2 .

5 、

3 、

3 .

5 、

4 mmol/L 图2Mg2 + 浓度对扩增带型的影响(S8)

2 .

2 .

1 Mg

2 + 浓度的优化 Mg

2 + 浓度可能影响到引物退火温度 、模板与扩增产物特异性 的强弱 、 引物二聚体的形成以及 DNA 聚合酶活性和精确度等诸多 方面 [10] . Mg

2 + 浓度过低 , Taq 酶有所失活 , 过高则会使引物的错配 频率增加 [11] . 该实验设置

8 个浓度梯度(0 .

5 ,

1 ,

1 .

5 ,

2 ,

2 .

5 ,

3 ,

3 .

5 ,

4 mmol/L) , 电泳结果如图

2 显示 , 在Mg

2 + 浓度为

2 .

5 mM , 扩增 条带多且清晰 .

2 .

2 .

2 模板 DNA 浓度对体系的影响 RAPD 分析时不同植物使用的模板 DNA 浓度各不相同[12] . 浓 度过低 , 分子碰撞几率降低 , 引起扩增条带少且不稳定 ;

模板含量过 高,又会相应增加非特异产物的扩增 , 造成弥散型电泳结果 . 在该实验中 , 当模板 DNA 为15 ng 时,扩增出 的条带丰富且清晰(见图 3) .

2 .

2 .

3 Taq 酶用量对反应体系的影响 图4表示不同 Tag 酶用量对扩增带型的影响 . 当Taq 酶为

0 .

5 U 时,扩增条带少(1 泳道) ;

当为1 . 5U 时,扩增条带多且清晰(3 泳道) . 当为更高的浓度下 , 非特异性扩增增强 、 背景亮 、 弥散现象严重 . 因此 , Taq 酶应选用

1 .

5 U .

2 杭州师范学院学报(自然科学版)

2007 年M:marker

1 ~

8 分别是 DNA 的浓度 :

10 、

15 、

20 、

22 .

5 、

25 、

27 .

5 、

30 、

35 ng 图3模板 DNA 浓度对扩增带型的影响(S8) M : marker ;

1 ~

6 分别是酶用量 :

0 .

5 ,

1 ,

1 .

5 ,

2 ,

2 .

5 ,

3 U 图4Taq 酶用量对扩增带型的影响(S8)

2 .

2 .

4 引物浓度对反应体系的影响 由图

5 所示 : 当引物浓度水平小于