PDF《付再萍》

0 .

05 μmol/L(1 泳道)时,扩增带少 、 亮度弱 , 扩增效果不理想 ;

当引 物浓度为

0 .

15 μmol/L(3 泳道)时,扩增条带的数量多且清晰 ;

而引物浓度为

0 .

2 ~

0 .

3 μmol/L 时,背景 很亮 , 出现弥散现象 . 引物浓度应采用

0 .

15 μmol/L .

2 .

2 .

5 dNTP 浓度对反应体系的影响 dNTP 是PCR 反应的基本单位 , 其浓度大小直接影响产物的质量 、 特异性及合成的可靠性 . 过高会导 致聚合酶错误的渗入 , 过低又会影响合成效率 , 而影响扩增效果 [13] . 此实验在

50 ~

300 μM 之间 , 设置了不 同的 dNTP 浓度梯度 . 结果发现 , dNTP 浓度为

50 ,

100 μmmol/L 时扩增条带少而且不清晰 , 浓度为

150 和200 μmmol/L时扩增条带多而清晰 , 浓度为

250 和300 μmmol/L 时非特异性扩增较多(见图 6) . 因此 , dNTP 浓度选在

200 μmmol/L 较合适 . M : marker ;

1 ~

6 分别是引物浓度 :

0 .

05 ,

0 .

1 ,

0 .

15 ,

0 .

2 ,

0 .

25 ,

0 .

30 μmol/ L 图5引物浓度对扩增条带的影响(S8) M : marker ;

1 ~

6 分别是 dNTP 浓度 :

50 、

100 、

150 、

200 、

250 、

300 μmol/L 图6dNTP 浓度对扩增带型的影响(S11) M : marker ;

1 ~

8 :

35 、

36 、

37 、

38 、

39 、

40 、

41 、

42 ℃ 图7退火温度对扩增带型的影响(S8)

2 .

2 .

6 退火温度对反应体系的影响 退火温度是影响 RAPD 反应最重要的条件之一 , 它具 有相对的灵活性 , 是优化 RAPD 反应的重要控制措施 [14] . 在整个反应体系组成确定时 , 对于热循环中的退火温度设 置了

8 个梯度 , 看其对扩增结果的影响 . 由图

7 可见 , 温度 在39 ℃ 扩增条带清晰 . 温度低于

37 ℃ 或高于

41 ℃ , 不能得 到满意的结果 . 温度只要在许可范围内就可得到扩增产物 , 只是温度太低会出现非特异性片段 . 因此采用

39 ℃ 的退火 温度 .

3 讨论该试验通过对狗脊不同器官提取的 DNA 比较发现 , 幼嫩的狗脊叶片提取的 DNA 质量最佳 . 老的叶 片革质厚 、 富含多酚和多糖 , 提取时 , 往往与 DNA 缠在一起 , 形成粘稠的褐色混合物而难以得到适用于 RAPD 的高质量的 DNA , 因此该实验采取去除多糖与多酚的 CTAB 并加以改进 , 提取 DNA 之前 , 在65 ℃ 预热的提取液中加入 2% (V /V)的β\巯基乙醇 , 尽量减少酚被氧化 , 也及时钝化 DNase 酶,防止 DNA

3 狗脊蕨(Woodwardia j aponica (L .f . ) Sm)基因组 第2期DNA 提取与随机扩增多态性 DNA (RAPD)的优化 被降解 . RAPD\PCR 优化中 , PCR 混合物中的 DNA 模板 、引物 dNTP 的磷酸基团均可与 Mg

2 + 结合 , 降低 Mg

2 + 实际浓度 . Taq 酶需要的是游离的 Mg

2 + . 另外 , 引物和模板 DNA 原液中如含 EDTA 等螯合剂也会 影响游离的 Mg2 + 浓度 . 引物的退火温度决定着 PCR 的特异性 . 所需的温度取决于引物的碱基组成 、 长度和浓度 , 合适的退火 温度一般低于引物在 PCR 条件下真实 Tm(Tm = 4(G + C)+ 2A + T )) [14] 值的

5 ℃ . 对于 RAPD 通常使用 的10 个碱基的引物 , 退火温度一般低于

40 ℃ , Williams 指出 ,

0 ℃ 以上的退火温度会抑制 RAPD 反应 . 该 实验采用了多种引物进行退火温度的优化 , 发现不同的引物对退火温度的要求也是不一样的 . 因此 , 建议 不同的引物采用不同的退火温度 . dNTP 是反应中磷酸的主要来源 , 是合成 DNA 的原料 , 其浓度略高一些 , 可以保证 PCR 扩增反应的 完全 , 因为在浓度低于 200μmol/L 时可以看到扩增条带明显减少 . 但如果 dNTP 浓度过高 , 就会与 Taq 酶 竞争 Mg